木霉菌对莴苣菌核病防治效果研究

罗军　杨蓉　黄蕾蕾　唐秀梅　王孝源　刘鹏　朱森林　邢承华

摘要：【目的】明确2种木霉对莴苣菌核病的防效差异，为揭示木霉菌的作用机理及应用于莴苣菌核病防治提供科学依据。【方法】在单因素试验基础上，采用响应面法进行木霉固体发酵条件优化试验，获得2种木霉（棘孢木霉和深绿木霉）的最佳发酵优化条件;以碧玉莴笋为材料，进行盆栽莴笋灌根接种木霉发酵液和核盘菌悬浮液处理（处理1：棘孢木霉+核盘菌;处理2：深绿木霉+核盘菌;处理3：核盘菌;处理4：50%多菌灵可湿性粉剂800倍液+核盘菌;处理5：无菌水），观察莴苣生长情况，并分别于接种后第3、6、9、12和15 d测定莴笋叶片抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）]活性、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）及叶绿素含量。【结果】2种木霉发酵液均能在一定程度上减轻核盘菌对莴苣的侵害，提高植物抗氧化酶活性，其中深绿木霉处理下莴苣叶片的SOD、POD和CAT活性更高，与无菌水处理相比，接种后12 d达最大增长率，分别为85.32%、78.05%和43.50%;與核盘菌处理相比，棘孢木霉和深绿木霉处理的MDA、Pro含量明显下降，最大降幅分别为17.16%、28.41%和29.48%、30.44%;木霉能有效抵御核盘菌对植物造成的侵害，其中深绿木霉的促进作用更明显，处理后6～15 d的叶绿素含量显著高于棘孢木霉处理（P<0.05，下同），最高为刺孢木霉处理组的1.112倍;木霉处理后可降低菌核病的发病程度，对莴苣菌核病具有较好防治效果，其中深绿木霉的防效达71.66%，显著高于棘孢木霉和多菌灵处理组。【结论】棘孢木霉和深绿木霉对核盘菌均具有明显的拮抗作用，可在一定程度上防治莴苣菌核病，其中深绿木霉的防治效果更佳，可将其应用于莴苣菌核病的防治以提高莴苣产量和品质，同时可减少化学防治对环境造成的破坏。

关键词： 木霉;深绿木霉;莴苣;菌核病;生物防治

中图分类号： S436.36                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）12-2962-09

Abstract：【Objective】To explore the effects of two Trichoderma strains on Sclerotinia sclerotiorum on lettuce and provide scientific basis for revealing the mechanism of Trichoderma and its application in S. sclerotiorum control. 【Me-thod】Response surface methodology was used to optimize the solid-state fermentation conditions of Trichoderma based on single factor experiment， and the optimal fermentation conditions of two kinds of Trichoderma（T. asperellum and T. atroviride） were obtained. Jasper lettuce was used as material to treat the root of lettuce by inoculating Trichoderma fermentation broth and S. sclerotiorum suspension（Treatment 1： T. asperellum+S. sclerotiorum; Treatment 2： T. atroviride+S. sclerotiorum; Treatment 3： S. sclerotiorum; Treatment 4： 50% carbendazim WP 800 times liquid spray+S. sclerotiorum; Treatment 5： sterile water）. The growth of lettuce was observed， and the activities of antioxidant enzymes [superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD） and catalase（CAT）]， malondialdehyde（MDA）， proline（Pro） and chlorophyll contents in lettuce leaves were measured on the day 3， 6， 9， 12 and 15 after inoculation. 【Result】The two kinds of Trichoderma fermentation liquid could reduce the damage of S. sclerotiorum to lettuce to a certain extent， and improve the activity of antioxidant enzymes. Among them， the activity of SOD， POD and CAT reached the maximum growth rate after the treatment of T. atroviride， which were 85.32%， 78.05% and 43.50% respectively. Compared with S. sclerotiorum group， MDA and Pro content decreased significantly in T. asperellum and T. atroviride groups， with the largest decrease of 17.16%， 28.41% and 29.48%， 30.44% respectively. Trichoderma could effectively resist the damage of S. sclerotiorum to plants， and the effect of T. atroviride was more obvious. The chlorophyll content of 6-15 d after treatment was significantly higher than that of T. asperellum group（P<0.05， the same below）， and the maximum growth rate was  as 1.112 times as that in T. asperellum. Trichoderma treatment could reduce the incidence of S. sclerotiorum， and had fine control effect on lettuce S. sclerotiorum. Among them， the control effect of T. atroviride was 71.66%， which was significantly higher than that in T. asperellum and carbendazim groups. 【Conclusion】Both T. asperellum and T. atroviride have obvious antagonistic effect on S. sclerotiorum， and can control S. sclerotiorum of lettuce to a certain extent. T. atroviride has better control effect， and can be applied to control the lettuce S. sclerotiorum to improve the yield and quality of lettuce， and redu-cing environmental damage through chemical control.

Key words： Trichoderma; Trichoderma atroviride; lettuce; Sclerotinia sclerotiorum; biological control

Foundation item： Basic Public Welfare Research Project of Zhejiang（LGN19C140003， LGN18C140006）

0 引言

【研究意义】莴苣（Lactuca sativa）为菊科（Compositae）莴苣属（Lactuca）1～2年生草本植物，作为一种常见蔬菜在我国各地普遍栽培，其地上与地下部分均具有极高的食用和药用价值。近年来，由于农作物种植密度增大、结构趋向单一及病原拮抗菌减少等原因，莴苣菌核病等蔬菜土传病害愈发严重。莴苣菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的常发性病害，核盘菌寄主范围广，可通过分泌草酸和植物细胞壁降解酶类等侵害植物组织（李双胜，2013），对莴苣的产量和品质造成极大影响。已有研究证明，木霉（Trichoderma）是一类环境友好型的生防真菌，可引发植物体内免疫相关酶类基因表达上调或激活免疫相关信号通路以增强寄主植物对病原菌的抗性（Nagaraju et al.，2012）。因此，探索不同木霉对莴苣菌核病的防治效果，对进一步探明莴苣菌核病致病机理及提高莴苣产量和质量具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内外已有将木霉应用于植物病害防治的相关报道，主要是针对黄瓜枯萎病（谷祖敏等，2015）、番茄灰霉病（李纪顺等，2018）、水稻纹枯病（Swain et al.，2018）、辣椒疫病（叶旻硕等，2019）和烟草黑胫病（Phytophthoranicotianae breda）（宋玉娟等，2020）等植物病害开展研究。不同木霉对各种植物土传病害的防治效果不一，研究发现长柄木霉（T. longbrachiatum）对烟草黑胫病的相对防效为69.3%（张良等，2013），黄绿木霉（T. aureoviride）T1010对花生根腐病的防病效果在73.79%以上（陈建爱等，2018）。可见，木霉具有较高的生物防治价值，但不同木霉对不同植物病害的防治效果存在差异。康彦平等（2017）发现拟康宁木霉（T. koningiopsis）可通过重寄生作用产生抗菌类代谢产物，消解花生核盘菌菌丝，抑制菌核形成，进而对花生菌核病产生拮抗作用。梁巧兰等（2017）对木霉蛋白质进行探究，发现深绿木霉T2中的蛋白质类物质TraT2A可激发百合对灰霉病的抗性，提高苯丙氨酸酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）等防御酶活性，对百合灰霉病表现出较强的防治效果。覃柳燕等（2017）研究表明，棘孢木霉（T. asperellum）菌株PZ6能通过提高香蕉叶SOD和过氧化氢酶（CAT）活性来清除活性氧，减轻细胞损害程度，从而增强香蕉植株的防病能力。赵兴丽等（2020）通过平板拮抗试验和温室盆栽试验，发现钩状木霉（T. hamatum）在辣椒根际定殖过程中对辣椒疫病具有生物防治作用，防治效果为53.33%。【本研究切入点】运用木霉菌防治植物土传病害已成为当前的研究热点，但关于木霉防治莴苣菌核病的探究甚少，且缺乏对比不同木霉对莴苣菌核病防效差异及应用的相关报道。【拟解决的关键问题】在单因素试验基础上，采用响应面法进行木霉固体发酵条件优化试验，获得2种木霉的最佳发酵优化条件，结合盆栽试验进行木霉灌根接种处理，观察莴苣生长情况，并测定莴苣叶片的抗氧化酶活性、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）及叶绿素含量等生理指标，以明确2种木霉对莴苣菌核病的防效差异，旨在获得对菌核病防治效果较好的木霉菌，为采用生物法防治莴苣菌核病提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试莴苣品种为碧玉莴笋，种子由重庆科光种苗有限公司提供。供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。供试菌株：选取来自于中国农业微生物菌种保藏管理中心的深绿木霉（T.atroviride，编号ACCC33804）、棘孢木霉（T. asperellum，编号ACCC 31650）和核盘菌（S. sclerotiorum，编号ACCC36453）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 试验设计 试验于2018年11月—2019年9月在浙江金华职业技术学院进行。先用清水浸泡种子8 h，再将种子放入冰箱冷藏室，4 ℃下冷藏72 h，然后取出种子放在荫凉潮湿处催芽。种子催芽后进行土培（5粒/盆），待萵苣苗长出4片真叶后，挑选长势较一致的苗株，灌根接种木霉发酵液和核盘菌悬浮液，设5个处理：（1）棘孢木霉+核盘菌;（2）深绿木霉+核盘菌;（3）核盘菌;（4）50%多菌灵可湿性粉剂800倍液+核盘菌;（5）无菌水（空白对照，CK）。每处理3个重复。试验在25 ℃、16 h光照的温室中进行。

1. 2. 2 单因素试验 分别以固基比（玉米渣∶麦麸）、透气性（纱布层数）、含水量和接种量4个因素进行单因素试验，探究同一因素不同梯度下木霉产孢量的差别。各因素水平见表1。

1. 2. 3 响应面试验 在单因素试验的基础上，以木霉在不同发酵条件下孢子的产量为响应值，以固基比、透气性、含水量和接种量为4个主要因素，采用Box-Behnken中心组合设计试验，对发酵培养条件的参数进行响应面优化，从而获得最佳发酵优化条件。

1. 2. 4 测定项目及方法 接种后3、6、9、12和15 d，各处理采集等量莴苣叶片样品于液氮中保存，分别采用NBT光化还原法（屠洁等，2003）、愈创木酚法（赵炀等，2015）和Na2S2O3滴定法（李小方和张志良，2016）测定抗氧化酶SOD、POD和CAT活性;采用硫代巴比妥酸法（Anantharaman et al.，2017）测定莴苣MDA含量;采用茚三酮显色法（杨敏文，2002）测定Pro含量;采用乙醇提取比色法（Batista et al.，2019）测定叶绿素含量。

最大增长率（%）=（木霉处理组-同周期无菌水对照组）/无菌水对照组×100

最大降幅（%）=（核盘菌处理组-同周期木霉处理组）/核盘菌处理组×100

1. 2. 5 木霉菌对莴苣菌核病病情指数和防治效果试验 在病情基本稳定后测定病株率与严重度，计算病株率、病情指数和相对防效。参照孙叶烁等（2019）的标准记载病情：0级，無病;1级，轻微发病，病斑长度0～0.8 cm;3级，轻度发病，病斑长度0.9～1.6 cm;5级，中等发病，病斑长度1.7～2.4 cm;7级，高度发病，病斑长度2.5～3.2 cm;9级，严重发病，病斑长度大于3.3 cm。

病情指数=∑（病级数×该病级发病株数）/（最高发病级数×总调查株树）×100

防治效果（%）=（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数×100

1. 3 统计分析

运用Design Expert 8.0.6对木霉最佳培养条件进行优化并制作3D Surface图。用SPSS 21.0和Excel 2016分析，计算平均值和标准误，以单因素方差分析法和Duncans新复极差法进行差异显著性分析，并用Origin 8.5制图。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

试验结果（表2和表3）表明，2种木霉均以固基比（玉米渣∶麦麸）=2∶1时的产孢效果最好;随着含水量的增加，2种木霉的产孢量均呈先增加后下降的变化趋势，当含水量达50%后产孢量开始下降，说明当环境达一定湿度后会抑制木霉菌丝的正常生长;棘孢木霉和深绿木霉分别在接种量为30和40 μL时的产孢效果最好;当纱布层数为6层时最有利于木霉的生长。

2. 2 2种木霉响应面条件优化结果

通过对数据进行多元回归拟合，建立固基比（X1）、含水量（X2）、接种量（X3）和透气性（X4）与木霉产孢量（Y）的二次回归模拟方程：棘孢木霉产孢量Y=（20.00+2.488X1-5.200X2-0.6046X3-1.842X4-6.625 X1X2-0.2625X1X3-0.7000X1X4+1.500X2X3+5.125X2X4-0.04875X3X4-7.825X12-4.431X22-11.21X32-9.618X42）×1010;深绿木霉产孢量Y=（30.00+0.5052X1-0.66488X2-0.6242X3-0.1570X4-1.492X1X2+0.01425X1X3+0.0335 X1X4-0.08325X2X3-0.5250X2X4-0.7525X3X4-1.494X12-1.4431X22-1.474X32-1.440X42）×109。

从响应面回归系数显著性分析结果可知，各因素对棘孢木霉产孢量的影响排序为X2（含水量）>X1（固基比）>X4（透气性）>X3（接种量），对深绿木霉产孢量的影响排序为X2（含水量）>X3（接种量）>X1（固基比）>X4（透气性）。通过三维响应面图（图1和图2）分析可知棘孢木霉4种影响因素固基比、含水量、透气性和接种量的优化值分别为：5∶2、40%、6层和30 μL，深绿木霉4种影响因素的优化值分别为：2∶1、45%、6层和40 μL。在最佳发酵条件下，棘孢木霉的产孢量为3×1011 CFU/mL，深绿木霉的产孢量为3×1010 CFU/mL，与预测值吻合较好，说明采用响应面法优化木霉产孢量有效。

2. 3 2种木霉对莴苣叶片抗氧化酶活性的影响

抗氧化酶具有保护植物免受氧化伤害的作用，与植物抗逆性密切相关。由图3可知，木霉处理组（处理1和处理2）的SOD、POD和CAT活性均呈先上升后略微下降的变化趋势，最终抗氧化酶活性均保持在高于多菌灵处理组的水平。2种木霉对莴苣叶片抗氧化酶活性的影响程度存在一定差异，深绿木霉处理下莴苣叶片的SOD、POD和CAT活性更高，与无菌水处理组比较，抗氧化酶活性在接种后12 d达最大增长率，分别为85.32%、78.05%和43.50%。可见，深绿木霉可较好地激活植物的抗氧化酶系统，在一定程度上缓解氧化损伤。

2. 4 2种木霉对莴苣叶片MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化的主要产物，其含量可反映膜结构受害程度及机体的自我修复能力（Cao et al.，2019）。由图4可知，棘孢木霉处理组的MDA含量呈先降后升的变化趋势，与同周期核盘菌处理组相比，其最大降幅为17.16%，深绿木霉处理组的MDA含量显著低于核盘菌处理组，最大降幅为29.48%。由此可知，木霉处理后可通过减少MDA积累以防止膜脂的过氧化作用。接种一段时间后，深绿木霉处理组的MDA含量明显低于棘孢木霉和多菌灵处理组，说明深绿木霉对菌核病的防治效果优于棘孢木霉和多菌灵。

2. 5 2种木霉对莴苣叶片Pro含量的影响

Pro是调节植物细胞渗透平衡和稳定生物大分子结构的一种蛋白质组分。从图5可看出，核盘菌处理组莴苣叶片Pro含量明显增加，所受胁迫最严重，但木霉处理后Pro含量显著降低（P<0.05，下同），在一定程度上缓解了核盘菌对莴苣造成的伤害。将2种木霉的处理效果进行比较发现，深绿木霉处理组Pro含量在接种后3～15 d均低于棘孢木霉处理组，但差异不显著（P>0.05），由此可知深绿木霉对核盘菌的拮抗作用较佳。棘孢木霉、深绿木霉和多菌灵3个处理组的Pro含量与核盘菌处理组相比最大降幅分别为 28.41%、30.44%和26.02%。可见，2种木霉对莴苣菌核病的缓解作用优于化学药剂。

2. 6 2种木霉对莴苣叶片叶绿素含量的影响

在逆境条件下，叶绿素含量与光合作用的强弱密切相关，可直接反映植物光合生理的情况。由图6可知，只接种核盘菌处理组的莴苣叶片叶绿素含量随处理时间的延长不断下降，推测核盘菌可使叶绿素的合成受阻，进而造成莴苣光合作用强度不断减弱;而木霉处理组的莴苣叶片叶绿素含量呈先下降后上升的变化趋势，且均显著高于核盘菌处理组，表明木霉能有效抵御核盘菌对植物造成的侵害。其中，深绿木霉的促进作用更明显，处理后6～15 d深绿木霉处理组的莴苣叶片叶绿素含量均显著高于棘孢木霉处理组，最高为棘孢木霉处理组的1.112倍，表明不同木霉对植物光合生理的影响具有差异性，且深绿木霉可更好地缓解核盘菌对莴苣光合系统造成的损伤。

2. 7 2种木霉对莴苣菌核病病情指数和防治效果的影响

由图7-A可知，各处理病情指数以核盘菌组最高，深绿木霉最低，其中棘孢木霉和深绿木霉组的病情指数分别为45.28和23.25，均显著低于核盘菌处理组和多菌灵处理组，说明木霉处理后可较好地降低菌核病的发病程度，且木霉的防治效果优于多菌灵。2种木霉对莴苣菌核病的防治效果不一，其中深绿木霉的防效高达71.66%，显著高于棘孢木霉和多菌灵处理组（图7-B）。表明木霉可在一定程度上增强莴苣的抗逆性，降低菌核病的发病率和发病程度。

3 讨论

木霉是自然界广泛分布的一类生防真菌（Gadhi et al.，2020），大多数木霉对土传病原真菌具有广谱拮抗作用（Salas-Marina et al.，2011）。作为一种重要的生防因子，木霉可激活寄主自身的物理或化学屏障（Saravanakumar et al.，2016），诱导植物产生系统抗性或局部抗性等发挥生防作用，从而增强其抗病能力（张春秋等，2018）。植物体内的SOD、CAT和POD是细胞内活性氧代谢的主要调节酶（李晓曼和王建军，2019），其主要作用是分解清除因活性氧代谢产生的H2O2，避免超氧自由基对细胞膜的攻击（李艳娟等，2017）;POD还是木质素合成的关键酶之一，其在体内的活性变化能反映细胞受损坏程度（覃柳燕等，2017）。孙冬梅等（2010）在叶面接种大豆菌核病菌后测定相关酶活性变化，发现施用木霉拮抗菌剂可促进相关酶活性的提高。本研究结果表明，核盘菌处理下莴苣的抗氧化酶系统呈先增后减的变化趋势，说明莴苣受核盘菌侵害后会发生氧化应激和膜脂过氧化反应，短时间激活植物体内抗氧化酶防御系统进行抵抗，但长时间下导致细胞代谢无法正常进行。而施加2种木霉后，莴苣叶片的SOD、CAT和POD活性明显提高，说明木霉可在一定程度上提高莴苣体内的抗氧化酶活性，且深绿木霉组的抗氧化酶活性明显高于棘孢木霉组，深绿木霉在莴苣根部的定殖能更好地增加植物体内与防御有关酶的合成或积累，增强莴苣的抗氧化酶防御系统。

当胁迫强度超过植物体内抗氧化酶对活性氧自由基的清除能力时即发生膜脂过氧化，MDA含量会上升（张红楠等，2018）。本研究结果显示，木霉处理后MDA含量明显降低，伴随着抗氧化酶活性的增高，说明木霉能激活植物体内的抗氧化酶活性，从而引起免疫相关酶类基因表达上调，较大程度地减少MDA积累，以防止膜脂过氧化，提高寄主对病原菌的抗性，与Zhang等（2016）、尤佳琪等（2019）发现木霉拮抗菌剂可提升感染菌核病植物的相关酶活性来降低MDA含量的结果一致。而在核盘菌侵害下拮抗菌对莴苣体内活性氧清除能力及细胞膜保护效应会随时间的延长有所减弱。施加木霉种类的不同对莴苣的抗病响应也存在一定差异，接种深绿木霉可更好地增强莴苣的系统抗性，从而抵抗病原菌的侵害。当植物发生膜脂过氧化损伤时，必然引起体内渗透系统发生紊乱，而Pro作为一种重要的渗透调节物质，其积累能保持原生质体渗透平衡及膜结构完整（Teh et al.，2016;吴雅文等，2018）。从本研究结果可知，核盘菌侵染下莴苣体内Pro含量显著上升，证实当植物受到逆境胁迫时，体内的Pro含量急剧增加（韩德鹏等，2019）;但接种木霉和多菌灵可降低植物体内Pro含量。棘孢木霉和深绿木霉处理组Pro含量与核盘菌组相比最大降幅分别为28.41%和30.44%，均低于多菌灵处理组，说明木霉能有效缓解核盘菌对莴苣的危害，且2种木霉对莴苣菌核病的缓解作用优于化学药剂，与Shukla等（2014）发现哈茨木霉可降低莴苣体内Pro含量，缓解盐胁迫的结论相符。可见，木霉有助于缓解核盘菌对植物的侵害，维持植物体内的渗透平衡，增强植物的抗逆能力。

叶绿素作为绿色植物体内最重要的营养色素，其含量与光合作用密切相关，也间接反映了植物抗逆性（Mauro et al.，2011）。Guler等（2016）研究发现深绿木霉能增加玉米（Zea mays L.）的叶绿素含量，进而增强其在逆境下的光合作用。本研究结果显示，各木霉处理组的莴苣叶片叶绿素含量显著增加，说明木霉可提升植物的光合能力，维持光合电子传递的正常进行（李江鹏等，2019;刘领等，2019）。但2种木霉对莴苣光合作用的影響存在一定差异，其中深绿木霉对莴苣叶绿素含量的促进作用更强，表明深绿木霉能更好地降低病原菌对光合系统造成的伤害，提高莴苣对不良环境的适应性。

不同木霉对病原菌的防治效果存在差异。李松鹏等（2018）对比了3种木霉对水稻纹枯病的防效，最低和最高防效分别为49.25%和80.60%。王依纯等（2019）对3种木霉的抑菌活性及防病效果进行初步研究，发现木霉对黄瓜枯萎病的防效在65%～82%，其中哈茨木霉610的防效最佳。本研究分析了不同处理组莴苣菌核病的病情指数和防治效果，发现木霉处理组间的病情指数存在差异，且均低于多菌灵处理组，其中深绿木霉的防治效果最佳，达71.66%，说明木霉可对土传病害进行防治，且种类不同，防治能力具有一定差异。

4 结论

木霉对莴苣核盘菌具有明显的拮抗作用，其能通过增强莴苣体内抗氧化酶活性、增加叶绿素含量及调节机体渗透作用等方式减缓核盘菌对植物造成的危害，从而降低莴苣的发病率和病情指数。其中，深绿木霉的防治效果更佳，可将其应用于莴苣菌核病的防治以提高莴苣产量和品质，同时可减少化学防治对环境造成的破坏。

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（責任编辑 麻小燕）