关于DMSO和BSA对全血DNA扩增的影响研究及对比

李雨衡 林仁露 刘泉

摘要：目的为了使在犯罪现场提取的微量有污染的DNA可以被准确检测出来。方法通过使用全血样本，在进行PCR直扩过程中加入DMSO或BSA，并测序后得出最后结果，比较两种试剂的增强效果。结果两种方法都不同程度的提高了DNA的扩增量，使其检出率大大提高了。结论2mg/ml的BSA，0.4mg/ml的DMSO很大程度的提高了DNA的扩增量和检出率。

关键词：全血样本;血红素;PCR;STR;DMSO;BSA

作為目前法医物证检验鉴定的常规技术，对生物检材中的DNA进行扩增是DNA分型中的一个重要环节，而要使DNA分型能够顺利进行，就必须提高PCR扩增的高效性和灵敏性。在刑事案件现场收集到的DNA检材通常会有一定的污染，其会使检材无法被准确检测出来，这也是PCR扩增失败的主要原因。

目前，血液中的血红素已被证实为PCR抑制物之一[1]，而血液作为刑事案件中常见的生物检材，在PCR领域中具有较高的研究价值。当前，国内外学者的大量研究以及法医学的大量实践可证实，一定浓度的DMSO或者BSA可提高DNA扩增量，但超过一定浓度也会导致PCR扩增效率的降低，且它们的浓度数值关系研究得不够清楚。尽管市场上已存在很多全血直扩试剂盒，但由于对相关促进PCR扩增试剂浓度数值关系的不确定，造成其扩增效力也不尽相同。通过本次课题研究，对比出DMSO和BSA对PCR扩增的影响大小，以及各个合适浓度值来作为PCR增强剂。

1 材料

1.1 检材提取

采血前让志愿者洗净双手，并用70%乙醇溶液消毒。用采血器采血后用吸血器吸取，然后滴取在已消毒的滤纸上。标明姓名和时间。

1.2 仪器

（1）分析天平。

（2）移液器。

（3）震荡仪。

（4）打孔器。

（5）纯水仪。

（6）高速离心机。

（7）7500PCR扩增仪（由美国应用生物系统公司提供）。

（8）3500测序仪（由美国应用生物系统公司提供）。

1.3 试剂

（1）A27plex试剂盒。

（2）BSA（10mg/ml）。

（3）DMSO（1.1mg/ml）。

（4）Taq DNA聚合酶。

（5）甲酰胺。

（6）Ladder。

（7）Liz内标。

1.4 主要试剂配制

（1）BSA：分别取0.01g、0.02g、0.03g、0.04gBSA于2mlEP管中，加入纯水至2ml。使其浓度依次为5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml。

（2）DMSO：取浓度为1.1g/ml的DMSO2ml分装在2mlEP管中。

2 实验方法

2.1 PCR扩增步骤

2.1.1 DMSO实验的扩增前的实验步骤

（1）在带有血样的滤纸上标上姓名及采血时间后待其晾干。

（2）取0.2mlEP管6个放置于孔板上。

（3）用已消毒的打孔器在有血样的滤纸片上打孔（每次一下），将所得血样粒放入0.2mlEP管中，每个EP管中放置两粒。

（4）取1个0.2mlEP管放置在孔板上。

（5）取24μLMix，12μLPrimer，2.4μLTaq DNA聚合酶于一0.2mlEP管中，并置于震荡器混匀。

（6）将最大量程为10μL的移液器调至6.4μL，将（2）中混合液取6.4μL，分装于6个含有血样的0.2mlEP管中。

（7）将6个0.2ml1EP管分别标号为HO（对照）、HD0.2、HD0.4、HD0.6、阴性和阳性。

（8）然后依次加入3.6μLddH2O、0.2μLDMSO和3.4μLddH2O、0.4DMSO和3.2μLddH2O、0.6μLDMSO和3μLddH2O、3.6μLddH2O、1μL DNA Contral 9947A和2.6μLddH2O。

（9）将其放置于高速离心机中以4930rpm速率离心10秒。

2.1.2 BSA实验的扩增前的实验步骤

（1）在带有血样的滤纸上标上姓名及采血时间后待其晾干。

（2）取0.2mlEP管6个放置于孔板上。

（3）用已消毒的打孔器在有血样的滤纸片上打孔（每次一下），将所得血样粒放入0.2mlEP管中，每个EP管中放置两粒。

（4）取1个0.2mlEP管放置在孔板上。

（5）取24μLMix，12μLPrimer，2.4μLTaq DNA聚合酶于一0.2mlEP管中，并置于震荡器混匀。

（6）将最大量程为10μL的移液器调至6.4μL，将（2）中混合液取6.4μL，分装于6个含有血样的0.2mlEP管中。

（7）将6个0.2ml1EP管分别标号为HO（对照）、HD0.2、HD0.4、HD0.6、阴性和阳性。

（8）然后依次加入3.6μLddH2O、0.2μLDMSO和3.4μLddH2O、0.4DMSO和3.2μLddH2O、0.6μLDMSO和3μL ddH2O、36μLddH2O、1μLDNA Contral 9947A和2.6μLddH2O。

（9）将其放置于高速离心机中以4930rpm速率离心10秒。

2.2 PCR扩增热循环参数

（1）95℃预变性2min;

（2）94℃10s，60℃1.5min，循环28次;

（3）60℃延伸20min;

（4）4℃保温。

2.3 测序步骤

2.3.1 DMSO实验的测序的实验步骤

（1）取72μL甲酰胺，1.6μL Liz于0.2mlEP管中，并用移液器吹打若干次。

（2）将最大量程为10μL的移液器调至9.2μL，并将（1）中混合液按照顺序以9.2μL分装至96孔板中。

（3）顺次加入1μL Ladder，1μL 阳性对照，1μL阴性对照，1μLH0，1μLHD0.2，1μLHD0.4，HD0.6。

（4）将孔板盖好后放入平板高速离心离心机中以4930rpm速率离心30秒后取出。

2.3.2 BSA实验的测序前的实验步骤

（1）取81μL甲酰胺，1.8μL Liz于0.2mlEP管中，并用移液器吹打若干次。

（2）将最大量程为10μL的移液器调至9.2μL，并将（1）中混合液按照顺序以9.2μL分装至96孔板中。

（3）顺次加入1μL Ladder，1μL阳性对照，1μL阴性对照，1μLH0，1μLHB0.5，1LHB1.0，HB1.5，HB2.0，HB3.0，HB6.0，HB9.0。

（4）将孔板盖好后放入平板高速离心离心机中以4930rpm速率离心30秒后取出。

3 实验结果

由于基因峰值升降趋势大致相同，故随机抽取三对碱基：D7S820，D18S51，D8S1179为例进行数据统计。

3.1 DMSO对全血PCR扩增效率影响的实验结果

3.1.1 实验数据统计表（如表1所示）

3.1.3 实验结果分析

根据统计数据可得，当DMSO体积分数为0至4%时，DMSO对全血样本PCR扩增效率随着DMSO体积分数的升高而升高;当DMSO体积分数为4%至6%时，DMSO对全血样本扩增效率随着DMSO体积分数的升高而降低。其中，根据统计图中峰值可判断出DMSO对提升全血样本扩增效率的最适体积分数是在4%，由此得出关于DMSO的一种增强剂为0.4mg/ml的DMSO。

3.2 BSA对全血PCR扩增效率影响的实验结果

3.2.1 实验数据统计表（如表2）

3.2.3 实验结果分析

根据统计数据可得，当BSA浓度为0至2mg/ml时，BSA对全血样本PCR扩增效率随着BSA浓度升高而升高;当BSA浓度为3至9mg/ml时BSA对全血样本PCR扩增效率基本进入平台期。其中，当BSA为2mg/ml时全血样本PCR扩增效率最为明显，由此得出关于BSA的增强剂为2mg/ml的BSA。

3.3 组间实验结果分析

根据表1、2的实验数据，可得当DMSO体积分数为4%、BSA浓度为2mg/ml分别对应提高全血PCR扩增效率的最佳浓度。

对于上述统计结果，发现两种不同的增强剂对于不同的基因链条扩增效果的影响不同，但相对于空白组H0都较大程度增加了DNA的扩增量。从局部来看，单独使用BSA（HB2.0）的效果普遍获得的碱基数量针对基因D7S820扩增量是最高的，远远超过DMSO（HD0.4），但对于剩余两组基因单独使用DMSO（HD0.4）要比BSA（HB2.0）扩增所得的碱基数量要高一些，由此无法对比出两者对于PCR反应的影响大小。

4 讨论

4.1 两种试剂对全血PCR效率影响的实验分析

由于本实验采用四色荧光测序，并且根据最终实验结果来看，DNA峰值升降趋势相同，因此以每一组荧光所代表的碱基对为单位，从每一组荧光测序组中随机选择一对碱基进行实验数据统计。

4.1.1 对加入DMSO的实验分析

DMSO是一种无色无味透明液体，有吸水性，分子式为，见图4。分子含有一个极性非常高的键和两个相同的非极性基团，因此，它既可溶于非极性溶剂又可溶于极性溶中，因为这种物理化学特性，可以作為一些不溶于水的化合物的有效溶剂，并且可以破坏水分子之间的氢键。工业上被用于溶剂和萃取剂。在生物学研究中，它可以作为一个优良的溶剂，而在医药治疗中，它可以作为有效的溶媒介物，因此可以用于PCR整个反应体系使之充分混合，同时DMSO也作为变性剂可直接解除模板DNA的局部二级结构，从而增加引物和模板的特异性结合，降低非特异性结合，最终获得满意的扩增效果。

在徐葵，邱志明，汪晓英《DMSO对PCR扩增反应的影响》一文中[3]，受解决δ受体基因屡次失败，从而使用体积分数为6%至13%DMSO时，使其顺利扩增的启发。将预实验中DMSO的体积分数分别定为6%，8%和10%。但实际操作中，用体积分数为6%，8%和10%的DMSO进行实验的实验结果表示，当DMSO体积分数超过6%时，会对全血样本PCR的扩增效率起到抑制作用。因此，以6%的体积分数为界限，研究体积分数为2%，4%，6%时对实验结果的影响。

通过对表1和图1的实验数据进行分析可得，当DMSO体积分数为2%至4%时，全血PCR扩增效率逐渐升高，在其体积分数为4%时达到峰值;其体积分数超过4%后，全血PCR扩增效率逐渐降低。可分析出，对A21plex试剂盒而言，当DMSO体积分数小于4%时，可直接接触全血DNA模板的局部二级结构，加强引物和全血DNA模板的特异性结合;当DMSO体积分数大于4%时，DMSO会对Taq DNA聚合酶产生抑制作用。而Taq DNA聚合酶作为PCR扩增所需材料，一旦其失去活性，会导致PCR扩增效率的下降。