不同辅助方法对刺玫果总多酚提取率的影响

戴鹂莹，雷永平，王晓林，邸 松，钟方丽

(吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022)

山刺玫生于山坡灌木丛间、杂木林中或在河流两岸的沼泽地边缘及漫滩的土堆、沙岗、堤坝和通风向阳处[1]，其果实称为刺玫果，广泛分布于东北等地区[2].当前刺玫果的提取工艺多集中于黄酮[3]、皂苷[4]、总三萜酸[5]等活性成分，而针对总多酚提取的资料极少，酚类化合物作为对人体健康有益的重要贡献者，具有预防心血管疾病[6-7]等功效，因此对刺玫果中总多酚提取的关注有待提高.

当代食品的开发与利用多结合新型技术来实现绿色食品的生产，其中离子液体在天然植物活性成分提取领域已有所应用,如从黑果腺肋花楸果中提取花青素、从黄柏中提取总生物碱等[8-9]，与传统有机溶剂相比，它具有性质稳定、挥发性低、溶解能力高等特点，更加绿色环保.超声波[10-12]、微波[13]具有设备简单，适用范围广，提取效率高，省时，节省试剂等特点，也广泛应用于天然产物活性成分的提取研究.本试验比较了不同辅助方法对刺玫果总多酚提取率的影响，从而选择最佳提取方法为后续研究和开发提供依据.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

刺玫果(Fruit of Rosa davurica Pall.)：采自吉林省吉林市丰满区小白山；没食子酸：纯度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司；氯化-1-丁基-3-甲基咪唑：纯度99%，上海成捷化学有限公司；其他试剂均为分析纯.

紫外-可见光光度分析仪：TU-1950，北京普析通用仪器有限责任公司；双频超声波微波紫外光组各催化合成仪：XH-300UL-2，北京祥鹄科技发展有限公司；恒温水浴锅：W5-100SP型，上海申生科技有限公司.

1.2 实验过程

1.2.1 刺玫果总多酚的提取

取粉碎的刺玫果干粉5.0 g，按照不同料液比，加入不同浓度的乙醇溶液，水浴回流提取，滤过，定容，作为供试品溶液.然后经离子液体辅助、超声辅助、超声-微波协同辅助等条件提取，同上处理后作为供试品溶液.

1.2.2 检测波长的确定

精密称取没食子酸对照品2.79 mg，置于50 mL容量瓶中，蒸馏水定容，得0.055 8 mg/mL的对照品溶液.取对照品溶液和供试品溶液各1.0 mL于10 mL容量瓶中，加6 mL蒸馏水，再加入0.5 mL福林酚试剂，摇匀，放置1 min后，再加入1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，蒸馏水定容，摇匀，放入70 ℃水浴中加热10 min，以相应的试剂做空白对照，在波长400～850 nm范围内进行扫描.结果显示，在761 nm处均具有最大吸收峰，故选此波长为检测波长.

1.2.3 标准曲线的绘制

分别吸取1.2.2项下的对照品溶液各0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于25 mL容量瓶中，按1.2.2项下的显色方法在761 nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为A=117.86C+0.130 3，R2=0.999 4，没食子酸在1.12～7.84 μg/mL具有良好的线性关系.

1.2.4 总多酚提取率的测定

吸取1.2.1项下的供试品溶液1.0 mL稀释定容于25 mL容量瓶中，吸取2.0 mL到10 mL容量瓶中，按1.2.2项下的显色方法在761 nm测定吸光度.代入标准曲线方程中，计算总多酚提取率.

1.2.5 传统溶剂提取方法

(1)传统溶剂提取单因素试验设计

以料液比(1：5、1：10、1：20、1：30、1：40、1：50，g：mL)、提取温度(40、50、60、70、80、90 ℃)、乙醇体积分数(0、10、30、50、70、90%)、提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)，提取次数(1、2、3次)五个因素作单因素试验.

(2)传统溶剂提取正交试验设计

根据单因素试验结果，选择料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、乙醇体积分数(D)四个因素进行正交实验，列出正交因素水平表，并进行试验.

(3)工艺稳定性验证试验

取5.0 g粉碎的刺玫果粉，按照料液比1：50加入50%的乙醇溶液，水浴温度80 ℃，提取2次，每次1.5 h，过滤，蒸馏水定容，测定吸光度，根据标准曲线计算出样品总多酚的提取率，重复3次.

1.2.6 不同辅助方式

(1)离子液体辅助提取

在“1.2.5.(3)”项试验基础上，选择离子液体氯化-1-丁基-3-甲基咪唑进行辅助提取，考察其质量浓度(0.05、0.1、0.2、0.3 mol/L)及提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)对总多酚提取率的影响.

(2)离子液体协同超声波辅助提取

在“1.2.6.(1)”项试验基础上，选择超声波辅助提取，考察不同超声功率(100、200、300、400、500 W)及超声时间(总提取时间不变，其中超声辅助时间分别为10、15、20、25、30、40、60 min)对总多酚提取率的影响.

(3)离子液体协同超声波-微波辅助提取

在“1.2.6.(2)”项试验基础上，选择超声-微波辅助提取，考察不同微波功率(100、200、300、400、500、600、700 W)及超声-微波时间(5、10、15、20、25、30 min)对总多酚提取率的影响.

2 结果与讨论

2.1 传统溶剂提取结果

2.1.1 单因素试验结果

(1)料液比的影响

由试验结果可知，总多酚提取率随着料液比的增大而增加，分析其原因可能是因为料液比太小时，不利于刺玫果中总多酚类物质的溶出，提取不完全，导致提取率较低.当料液比增大时，总多酚提取率逐渐增高，但料液比增大到一定程度时，继续提高料液比总多酚提取率提高效果不显著反而增加溶剂需求量，综合考虑，选择料液比1：50进入后续试验.

(2)提取温度的影响

由试验结果可知，总多酚提取率随着水浴温度的升高而增加，当水浴温度达到70 ℃时提取率达到最大值，继续升高水浴温度提取率反而下降，分析其原因可能是因为随着温度的提高，扩散速度增快，有利于刺玫果中总多酚类物质的溶出，但是随着温度的继续提高，部分多酚类物质结构发生变化，且更多的杂质溶出，使得提取率骤减，所以选择提取温度为70 ℃进入后续试验.

(3)乙醇体积分数的影响

由试验结果可知，总多酚提取率随着乙醇体积分数的增加而提高，当乙醇体积分数达到50%时提取率达到最大值，继续增加乙醇体积分数提取率开始下降，其原因可能是因为水对刺玫果总多酚的溶解度比乙醇高，而乙醇对植物细胞的破坏作用比水强，随乙醇体积分数的增大，提取溶剂的极性降低，会使色素等低极性物质提出[14],综合考虑，所以选择乙醇体积分数为50%进入后续试验.

(4)提取时间的影响

由试验结果可知，总多酚提取率随着提取时间由0.5 h延长到1.0 h达到最高值，继续延长提取时间提取率开始明显下降，分析其原因可能是因为提取时间长有利于刺玫果中的总多酚充分转移到提取液中，故提取率不断提高，而随着时间的继续延长，提取率有所下降，可能因为溶液中的总多酚在较长时间下被分解[15]，所以选择提取时间为1.0 h进入后续试验.

(5)提取次数的影响

由试验结果可知，当提取到第3次的时候，总多酚的提取率已经很小了，前2次提取率之和占提取率总和的94.73%，所以将提取次数确定为2次.

2.1.2 正交试验结果

由正交试验结果可知，料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、乙醇体积分数(D)对总多酚提取率均有一定的影响，影响大小顺序为A>D>B>C，最佳提取条件为A3B3C3D2，即料液比为1：50、提取温度为80 ℃、提取时间为1.5 h、乙醇体积分数为50%.

2.1.3 工艺稳定性验证试验结果

3次工艺验证性试验中总多酚的提取率分别为11.12、11.23、11.49 mg/g，平均为11.28 mg/g，RSD为1.68%，说明优选的提取工艺稳定可行.

2.2 不同辅助方式的试验结果

2.2.1 离子液体辅助试验结果

(1)离子液体质量浓度的影响

由图1(a)可知，在相同提取条件下，由于离子液体的加入，总多酚提取率有所提高，而且总多酚提取率随着离子液体浓度的升高而增加，当离子液体浓度达到0.1 mol/L时总多酚提取率达到最大值，继续增加离子液体浓度，提取率反而开始下降，分析其原因可能是因为离子液体浓度增加，其溶液粘度会继续增大，而使其继续渗透到刺玫果细胞壁的能力和总多酚溶出的能力都降低，故选择氯化-1-丁基-3-甲基咪唑的浓度为0.1 mol/L.

(2)离子液体提取时间的影响

由图1(b)可知，在0.1 mol/L的氯化-1-丁基-3-甲基咪唑辅助下，当提取时间为1.0 h时，总多酚提取率就可以达到12.82 mg/g，而当提取时间为1.5 h时，总多酚提取率达到最大值，继续增加提取时间，反而使总多酚提取率下降，分析其原因可能是因为总多酚从刺玫果细胞壁中溶出时需要一定时间，延长提取时间，总多酚的溶解度增大，提取率随之增大，但提取时间太长，有些多酚类物质的结构可能会发生变化[15]，使提取率降低，所以选择1.5 h为最佳提取时间.

离子液体浓度/(mol·L-1)(a)

离子液体浓度/(mol·L-1)(b)图1 离子液体的不同条件对刺玫果中总多酚类物质提取的影响

2.2.2 离子液体协同超声波辅助试验结果

(1)超声功率的影响

由图2(a)可知，随着超声功率的提高，扩散速度加大，总多酚提取率升高，当超声功率为200 W时，提取率达到最大值，而继续加大超声功率反而使总多酚提取率降低，分析其原因可能是因为超声功率低起不到辅助的作用，而超声功率太大可能会使部分多酚类物质的结构破坏，所以选择200 W为最佳超声功率.

(2)超声时间的选择

由图2(b)可知，超声辅助时间在30 min时，总多酚提取率即达到了最高值，继续延长超声辅助时间，可能会导致部分多酚类物质变性，使得总多酚提取率下降，所以选择超声辅助时间为30 min.

离子液体浓度/(mol·L-1)(a)

离子液体浓度/(mol·L-1)(b)图2 离子液体协同超声波的不同条件对刺玫果中总多酚类物质提取的影响

2.2.3 离子液体协同超声波-微波辅助试验结果

(1)微波功率的影响

由图3(a)可知，当将超声功率设定为200 W时，随着微波功率的提高，总多酚提取率升高，当微波功率为200 W时，提取率达到最大值，而继续加大微波功率反而使总多酚提取率降低，故选择200 W为最佳微波功率.

(2)协同提取时间的影响

由图3(b)可知，当将超声功率、微波功率均设定为200 W时，随辅助提取时间的延长，总多酚提取率不断升高，当协同辅助时间达到15 min时，总多酚提取率达到了最高值，继续延长提取时间，可能会导致部分多酚类物质被破坏，使得总多酚提取率下降，所以确定协同提取时间为15 min.

离子液体浓度/(mol·L-1)(a)

离子液体浓度/(mol·L-1)(b)图3 离子液体协同超声波-微波的不同条件对刺玫果中总多酚类物质提取的影响

3 结 论

(1) 本试验通过考察液料比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度对刺玫果总多酚提取率的影响，经单因素和正交试验优化得到传统溶剂提取刺玫果中总多酚的最佳工艺条件为：料液比1：50、提取溶剂为50%的乙醇溶液、提取温度80 ℃，提取1.5 h，总多酚提取率为11.28 mg/g.

(2) 试验中进一步考察了不同辅助条件对刺玫果中总多酚提取率的影响，经离子液体氯化-1-丁基-3-甲基咪唑(0.1 mol/L)辅助提取后刺玫果总多酚的提取率增加到12.97 mg/g；经离子液体协同超声波(200 W，30 min)辅助提取后刺玫果总多酚提取率提高到13.10 mg/g；最后经离子液体协同超声波-微波(超声200 W、微波200 W，15 min)辅助提取后刺玫果总多酚提取率增加到13.61 mg/g，较传统溶剂提取法提高了20%，离子液体在天然产物活性成分提取方面虽然有很多优点，但其回收难、成本高，对于离子液体的大规模应用，首先需要解决的就是其回收问题，这是本文后续研究的问题.试验结果表明，离子液体、超声波辅助、微波辅助均能提高刺玫果总多酚的提取率.该结果为今后刺玫果资源的综合开发利用提供了参考.