一株石油烃降解菌的鉴定及菌剂的制备研究

刘 虹，曾繁城，高鹏飞，刘翠珠，温 钢

(1.吉林化工学院 资源与环境工程学院，吉林 吉林 132022；2.北京市水文总站，北京 100089；3.吉林化工学院 生物与食品工程学院，吉林 吉林 132022)

石油烃是多种烃类的混合物，包括正烷烃、支链烷烃、环烷烃和芳烃等，这些化学组分一旦进入环境，通过食物链运输，将会表现出长期的毒性，对人类健康和环境都存在一定的影响，因此，石油污染的问题越来越受到重视[1].近年来，石油污染修复微生物技术得到了快速发展，与其它物理、化学修复技术相比，具有廉价、清洁等优势[2].目前已报道的降解石油烃的微生物约有100余属200多种，在实际应用中主要以细菌为主[3].在微生物修复石油污染环境的过程中，大多采用游离菌体或固体菌剂，与游离菌体相比，制备的固体菌剂具有稳定性好、易保存、使用方便等优点[4].

国内外相关研究大多集中在石油降解菌株的筛选与降解机理方面，鲜有涉及菌剂的研发与制备的报道[5].已有的研究报道中，叶峰等通过定向驯化活性污泥从而获得高活性混合菌种，然后将其接种至载体，经固体发酵培养制备复合微生物菌剂[6]；席北斗等将康氏木霉、白腐菌、变色栓菌与EM菌、固氮菌、解磷菌、解钾菌按一定配比扩大培养制成 5组复合微生物菌剂[7]；赵延君等对石油降解菌进行固定化，按照5%接种量接入活化后的目标菌，固定若干小时，最终得到的固定化菌剂[8].该研究从松原油田石油污染土壤中筛选出一株新的高效降解石油烃菌株，通过16S rDNA序列分析对其进行鉴定.并考察了制备其固体菌剂的最佳条件及菌剂对石油烃的降解效果，为石油污染环境的微生物修复提供了新的菌源及技术支持.同时，由于选取的菌剂载体为稻壳、核桃壳、玉米秸秆等废弃材料，在修复石油污染环境的同时，实现了废弃物的资源化.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

无机盐液体培养基(单位： mg/L)：(NH4)2SO42000，K2HPO41550，NaH2PO4850，MgCl2·6H2O 100，EDTA 10，FeSO4·7H2O 5.0，ZnSO4·7H2O 2.0，MnCl2·2H2O 1.0，CaCl2·2H2O 1.0，CoCl2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，CuSO4·5H2O 0.2.

原油培养基：无机盐培养基加入柴油.

主要仪器设备：LD4-2A 医用离心机、气相色谱仪(Agilent7890B)、手提式压力蒸汽灭菌器、SP-DJ系列垂直净化工作台、HZQ-QX 全温振荡器、PTC-200 型 PCR 仪(美国)等.

1.2 实验过程

1.2.1 总石油烃(Total Petroleum Hydrocarbon,简称TPH)测试方法

样品TPH采用气相色谱仪进行测定.

色谱条件：注入口温度280.0 ℃，载气为氮气，压力59.5 kPa，总流量37.7 mL/min；分流比为20.0；采用Rtx-1色谱柱，30.0 m×0.25 μm×0.32 mm，流量为1.65 mL/min，初始温度80.0 ℃下平衡3.0 min，按8 ℃/min升温速率升温至100 ℃，再按10 ℃/min速率升温至200 ℃，按15 ℃/min速率升温至280 ℃平衡15 min，总程序35.85 min.柱箱最大温度330 ℃；检测器温度290.0 ℃；进样体积为1.0 μL.

1.2.2 菌株的16S rDNA鉴定

16SrDNA基因的PCR扩增引物：上游引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；下游引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′.

PCR扩增条件：96 ℃预变性1 min，96 ℃变性10 sec，50 ℃退火5 sec，60 ℃延伸4 min，进行25个循环，最后于4 ℃保温.取5 μL 反应液与1 μL 6×上样缓冲液混合，在1%的琼脂糖凝胶中，于150 V电压下电泳检测.

引物合成及PCR产物测序均由上海生工生物工程技术有限公司完成.

1.2.3 菌剂载体的选择

选用废弃的稻壳、核桃壳、玉米秸秆作为菌剂载体，以上材料经粉碎后，过120目筛作为前体物，然后加入红木屑(纤维素)以及硅藻土或高岭土(稳定剂)制作载体.将载体接入菌悬液，于130 rpm，30 ℃摇床震荡培养2 d，然后置于40 ℃的烘箱烘干36 h，干燥后，将其研磨成粉末将固体菌剂接入4 000 mg/L原油培养基中，于130 rpm，30 ℃摇床中培养6 d，用正己烷萃取(培养液：正己烷=5：1).萃取后的有机相用无水硫酸钠干燥后，采用气相色谱仪测定TPH的残留量，计算其降解率.实验同时设有2个平行样，并辅以不接菌剂的空白样作为对照.

1.2.4 不同菌剂制备条件

(1)不同料水比

载体与水的比例分别选取0.5：1、1：1、1：1.1、1：2、1：2.5进行实验，往菌剂中加入水的pH为7，接菌量50%，烘干温度40 ℃，载体比例(稻壳/核桃壳/玉米秸秆：木屑：高岭土/硅藻土)85%：10%：5%制备固体菌剂.每组实验设2个平行样.将菌剂接入4 000 mg/L原油培养基中，于130 rpm，30 ℃摇床中培养6 d后测定石油烃残留量.

(2)不同烘干温度

分别选取30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃ 5种温度作为制备菌剂的烘干温度，进行5组实验，往菌剂中加入水的pH为7，接菌量50%，料水比为1：2，载体比例(稻壳/核桃壳/玉米秸秆：木屑：高岭土/硅藻土)85%：10%：5%制备固体菌剂.每组实验设置2个平行样.接入菌剂至4 000 mg/L原油培养基中，于130 rpm，30 ℃摇床中培养6 d后测定石油烃残留量.

(3)不同载体比例

在菌剂制备过程中分别选取载体比例75%：15%：10%、80%：10%：10%、80%：15%：5%、85%：10%：5%和90%：5%:5%，进行5组实验，往菌剂中加入水的pH为7，接菌量50%，料水比为1：2，烘干温度40 ℃制备固体菌剂.每组实验设置2个平行样.接入菌剂至4 000 mg/L原油培养基中，于130 rpm，30 ℃摇床中培养6 d后测定石油烃残留量.

2 结果与讨论

2.1 菌株的16S rDNA鉴定

将菌株16S rDNA序列输入Gen Bank数据库，以BLAST软件进行序列同源性比较，选择同源性大于98%的基因序列，采用Bioedit和MEGA5.0软件对L4进行系统发育分析，用Neighbor-joining法构建系统发育树，500次重复检测，计算自引导值(Bootstrap)以估计系统进化树的置信度.结果如图1所示.

图1 菌株YH基于16SrDNA的系统发育分析

由图1可知：YH菌与Stenotrophomonas acidaminiphila strain进化距离较近，判定YH菌株在分类学属性为：微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila strain).已有的研究表明，该菌株对芴具有较好的降解效果，在培养11 d后对芴的降解效果达到86.0%[9].另外，该菌株5 d内将15.4 mg/L的微囊藻毒素完全降解[10]，在32 ℃下主动降解丙烯酰胺[11]以及对铜具有较好的降解效果[12].而关于该菌株在石油烃微生物降解方面未见报道.

2.2 菌剂最佳载体的确定

由图2可以看出，使用硅藻土作为稳定剂，菌剂对石油烃降解率分别为76%、65%、63%，而使用高岭土的分别为63%、52%、43%，因此选用硅藻土作为稳定剂.所选的3种菌剂载体中，稻壳作为载体，菌剂对石油烃的降解率为76%、63%，玉米壳作为载体，降解率为65%、52%，核桃壳作为载体，降解率为63%、43%，因此选用稻壳作为制备菌剂的载体.

注：载体一：稻壳+硅藻土；载体二：稻壳+高岭土；载体三：玉米秸秆+硅藻土；载体四：玉米秸秆+高岭土；载体五：核桃壳+硅藻土；载体六：核桃壳+高岭土.图2 不同载体制备的菌剂对石油烃的降解效果

2.3 最佳菌剂制备条件的确定

2.3.1 最佳料水比的确定

降解效果见图3.

料水比图3 不同料水比的菌剂对石油烃的降解效果

从图3中可以看出载体制备过程中料水比为1：2时菌剂降解石油烃效果最好，降解率达到72.8%.料水比过低则不能使微生物充分生长，料水比过高可能导致烘干不彻底影响石油烃解.

2.3.2 最佳烘干温度的确定

从图4中可以看出，载体制备过程中，烘干温度为35 ℃时菌剂降解石油烃效果最好，降解率达到75.1%.温度过低或过高不利于微生物生长，在一定温度内升高温度会微生物的繁殖能力和活性，而温度过高则会直接杀死微生物，从而影响TPH降解效果.

烘干温度/℃图4 不同烘干温度下菌剂对石油烃的降解效果

2.3.3 最佳载体比例的确定

由图5中可知，载体(稻壳：木屑：硅藻土)比例为80%：10%：10%时菌剂降解石油烃效果最好，降解率达到75.9%.其中，木屑作为纤维素，主要作用是给菌剂载体提供足够的菌群生长所需的空隙，硅藻土作为稳定剂，具有良好的湿度调节作用.纤维素与稳定剂过高或过低都不利于微生物的生长.

载体比例图5 不同载体比例的菌剂对石油烃的降解效果

3 结 论

(1)从松原石油污染土壤中筛选、分离得到一株新的高效降解石油烃菌株YH，通过16S rDNA序列分析，鉴定其为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila strain).

(2)选取废弃的稻壳、核桃壳、玉米秸秆作为菌剂载体，用YH菌株制备固体菌剂，其最佳制备条件分别为：料水比1：2、烘干温度35 ℃、载体(稻壳：木屑：硅藻土)比例80%：10%：10%.