脐带间充质干细胞治疗CIA 大鼠的疗效观察*

姚 瑶，葛卫红，曹 娟，丁从珠**

南京大学医学院附属鼓楼医院 1 药学部；2 老年科，南京210008

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因不明的自身免疫疾病，在世界范围内发病率约为0.5%，在我国为0.4%，炎症和骨破坏为RA 的两大主要病理表现[1]。目前的治疗药物仅能改善病情进展，不能治愈疾病。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多项分化潜能的多能干细胞，具有强大的免疫抑制和诱导免疫耐受功能，表现出抑制炎症增殖的特性，能够改善免疫系统紊乱引起的慢性炎症。MSC 已陆续在美国、加拿大、韩国、瑞士和日本等9 个国家批准上市，用于治疗系统性红斑狼疮等多种自身免疫疾病[2]；但是它对类风湿关节炎的治疗仍存争议。本研究即通过体内研究，观察MSC 治疗胶原诱导关节炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠的效果，为类风湿关节炎的治疗提供证据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

8 周龄SPF 级健康SD 大鼠50 只，雌性，体质量150～170 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可：SCXK（京）2016-0011，南京鼓楼医院动物实验中心饲养，适应性喂养3 天后用于实验。

1.2 仪器和试剂

水平式离心机（美国Wealtec 公司）；全自动酶标仪（美国Thermo 公司）；倒置显微镜（日本Olympus 公司）；超净工作台（北京半导体设备一厂）；病理组织切片机（上海徕卡仪器有限公司）。

细胞培养液、胰蛋白酶、青链霉素（批号：12100046、25200-056、15070063，均 为GIBCO 公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料公司）；甲氨蝶呤（MXT，阳性对照药，批号：170102，上海信谊药业）；II 型胶原酶、白介素-17（IL-17）、NFκB 配位体受体活化剂（RANKL）、可溶性蛋白骨保护素（OPG）、转化生长因子-β（TGF-β）试剂盒（均美国Sigma 公司）。

1.3 间充质干细胞制备

经知情同意后取得人源脐带，无菌条件下浸入DMEM/F12 培养液中，超净工作台内PBS 冲洗，将脐带剪碎至1～2 mm3组织块，转移至0.075%胶原酶Ⅱ溶液中，37 ℃搅拌消化30 min，PBS 再次清洗后，用0.125%胰酶37 ℃消化30 min。100 μm 细胞筛过滤，滤液离心，PBS 冲洗2 次。以1.0×106/cm2的密度接种于含L-DMEM 培养液的塑料培养瓶中，3～4 天更换培养液，去掉未贴壁细胞，以后每3 天换液1次。待细胞生长到80%左右融合时，显微镜下观察细胞的生长形态，确认细胞状况良好，符合移植要求后，以0.25%胰蛋白酶/EDTA 混合液消化，再用含10%小牛血清的DMEM 培养液清洗2～3 次，制成1.0×106/mL 细胞悬液以备移植用。

1.4 大鼠关节炎模型的制备

50 只SD 大鼠称重后，随机分为空白组10 只，其余40 只造模。将溶于醋酸的Ⅱ型胶原酶先于4 ℃低温保存过夜，第二天与完全弗氏佐剂以等体积乳化。乳化成功后，对拟造模的大鼠背部及尾部多点皮下注射，每只注射0.15 mL，诱导类风湿关节炎模型。首次注射的7 天后进行第二次注射，方法与首次注射相同。空白对照组按照相同方法注射等量0.9%氯化钠溶液（生理盐水）。

1.5 关节评分

首次免疫注射后每3 天称重1 次，每次固定两名实验员记录关节肿胀评分。关节肿胀评分标准：0 分为关节处无肿胀；1 分：趾关节微肿；2 分：趾关节及足趾处发生肿胀现象；3 分：踝关节以下的足爪发生肿胀现象；4 分：全部足爪肿胀（包括踝关节）。最终分数为大鼠四肢关节肿胀分数的总和，最高分为16 分。

1.6 药物治疗方案

首次免疫注射后第10 天关节肿胀大于4 分的大鼠认为造模成功，将成模大鼠随机分为：①MSC治疗组，予大鼠尾静脉注射1×106个MSC[3]；②模型组，予大鼠尾静脉注射等体积的生理盐水；③MTX阳性对照组，灌胃给予MTX（3.8 mg·kg-1），每周一次。④设空白组，于正常的SD 大鼠尾静脉注射等体积的生理盐水。实验共持续治疗4 周。为了评估MSC 的短期和长期治疗效果的差异，另设MSC 7天治疗组。

1.7 炎症因子测定

实验结束后，禁食一夜，次日于大鼠眼眶取血，ELISA 法测定血清中IL-17、RANKL、TGF-β 以及OPG 水平，按试剂盒说明书操作。

1.8 组织HE 染色

实验结束处死大鼠，分离大鼠后足关节，标本经10%甲醛固定后，常规石蜡包埋，4 μm 切片，HE染色。医学显微镜下作组织学观察。

1.9 统计学方法

采用SPSS19.0 统计软件分析，数据以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，最小显著差数（LSD）法进行两两比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 关节炎评分

每3 天由两名实验员分别对大鼠进行关节评分一次，得分取平均值，实验共进行4 周，关节炎评分走势图见图1。

因药物治疗效果有一定的延迟，在治疗10 天左右，关节评分达到一个高峰，之后模型组评分也略有下降；但MSC 尾静脉输注和甲氨蝶呤灌胃均可以降低CIA 大鼠关节炎评分。实验完成前模型组关节炎评分为8.8±1.3，MSC 组为2.4±1.1，显著低于模型组（P＜0.05）；MTX 治疗组关节炎评分为2.6±0.9；表明降低关节炎的作用，MSC 组与阳性对照MTX组无统计学差异（P＞0.05）。

2.2 大鼠血清细胞因子测定

CIA 大鼠尾静脉输注MSC 治疗RA（106个/只），实验结束测定大鼠血清中IL-17、RANKL、OPG、TGF-β、OPG 等细胞因子水平，见表1。

表1 各组大鼠血清IL-17、RANKL、TGF-β 水平（n=8）

以模型组和空白组作对照，甲氨蝶呤为阳性对照。结果提示：①模型组IL-17、RANKL、TGF-β 水平高于空白组（P＜0.05），验证造模成功。②经治疗，与模型组相比，MSC 组显著降低RANKL、TGF-β 水平，显著提高OPG 水平（P＜0.05）。③MSC 组对IL-17 的降低作用弱于甲氨蝶呤组，且仅维持较短时间，对OPG 的提高作用强于甲氨蝶呤组。

2.3 关节HE 染色

HE 染色结果显示（见图2），模型组关节炎性细胞侵润，已将腔隙填满（图2A），且血管翳清晰；空白组（图2B）边界清晰，软骨完好；MSC 治疗7 天组软骨组织完好，但间隙狭窄（图2C）；MSC 治疗28 天组（图2D）与空白组差异小，且与MTX 组（图2E）效果相当。

3 讨论

目前RA 的治疗主要为改善病情的抗风湿药（DMARDs），传统DMARDs 有甲氨蝶呤，为国内外“指南”推荐的一线治疗药物；但是药物起效慢、个体差异大、不良反应多。近年来TNF-α 抑制剂Etanercept、IL-6 受体拮抗剂Tocilizumab 等生物抗风湿药应用于临床，可有效改善病情；但仍有近1/3 的患者不能从中获益，更棘手的是，疾病早期即可出现关节破坏，一旦发生，尚无有效的恢复途径，因此亟需探索修复RA 关节损伤的新型疗法。MSC 是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可在特定条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、神经元等，是组织修复的重要细胞；MSC 还兼有免疫抑制、抗炎、抗纤维化等功效。以此为基础，MSC 移植治疗组织损伤和自身免疫性疾病成为研究热点。

本研究结果提示，MSC 与MTX 治疗效果相近，均能有效改善CIA 大鼠关节肿胀指数。Wang YH等[4]的研究显示，MSC 能够有效改善CIA 大鼠症状，且与MTX 联用可以提高治疗效果。边振宇[5]作RA大鼠模型实验，分别进行关节内、经静脉全身性注射以及关节内注射联合静脉全身注射MSC，结果表明，3 种方式均可降低RA 模型的关节炎指数，联合治疗效果更佳。与本研究结果吻合。

既往的研究提示，MSC 可以通过调节T 淋巴细胞，发挥免疫调节作用，具体表现为抑制T 淋巴细胞的增殖和活化[6]，这可能也是其治疗类风湿关节炎的重要机制之一。MSC 通过抑制细胞分裂，使T淋巴细胞阻滞于G0/G1 期，一是通过细胞间相互作用；二是通过可溶性细胞因子实现，MSC 分泌的可溶性细胞因子（TGF-β、HGF、IL-6、IL-10、PGE2、NO、IDO 等）作用于T 淋巴细胞间抑制其增殖能力与活性[7]。对于TGF-β 的研究争议较多，既往认为它是一种抑炎因子。赵成等[8]的研究提示，MSC 可能通过抑制促炎因子IL-6、IL-1 和TNF-α，以及上调抑炎因子TGF-β 来发挥抗炎作用。但是，近年来的研究却又指出，TGF-β 参与RA 滑膜成纤维细胞的迁移和浸润，是导致RA 发病的重要炎症因子[9]。Liu Y 等[10]的研究提示，MSC 主要是通过抑制TGF-β 分泌，抑制T 细胞活性，发挥治疗RA 的作用。在本研究中，MSC 尾静脉输注后能够显著降低TGF-β 水平，与Liu Y 等研究结论一致。除了滑膜成纤维细胞，Th17 细胞也是参与RA 发病的关键。Kim KW等[11]的研究表明，MSC 可以抑制RA 患者Th17 细胞的作用，降低IL-17 水平。但是在本研究中，治疗一周后IL-17 水平显著下降，且随着时间的推移，MSC对IL-17 的调节作用减弱，总体效果弱于MTX，这可能与MSC 的给药频次和剂量有关。

MSC 除了具有免疫调节作用外，还具有多向分化潜能，是RA 组织修复的理想种子细胞[12]。本研究虽然未直接观测到MSC 的归巢和成骨分化，但是结果提示，MSC 能够上调OPG 分泌，降低RANKL 的水平，从而抑制破骨细胞分化，促进成骨细胞的生成。同时，从HE 染色结果看，随着时间的推移，MSC能够抑制关节破坏的进程，其治疗效果与MTX 类似。有研究还发现，MSC 常规分泌大量OPG，在向破骨细胞诱导体系中加入MSC 或MSC 上清液后，破骨细胞的数量及cathepsin K、NF－ATc1 等破骨细胞分化关键基因的表达均受到显著抑制，这种抑制趋势与OPG 的水平呈正相关[13]。MSC 通过持续分泌OPG，在体外有效抑制了破骨细胞的分化。以上研究一定程度表明，当RA 急性期的强烈炎性反应控制后，在慢性炎症过程中，利用MSC 在RA 环境下成骨、软骨再生似乎成为可能。

综上所述，MSC 对于滑膜浸润和骨破坏有一定的治疗作用，还具有免疫调节及多向分化的双重作用，是RA 组织修复的理想种子细胞，可能弥补传统DMARDs 类在治疗RA 时的不足。今后研究方向将就MSC 的给药方式、频次和剂量等方面进行深入探讨，为RA 的临床治疗提供新的方法。