刺五加皂苷B/E 对乳腺癌MDA-MB-231 细胞迁移能力的影响及作用机制研究*

梁 睿，翟溯澜，吕梦雨，蒋艳婷，韦翠萍，郭冷秋**

1 苏州卫生职业技术学院 药学院&苏州检验医学生物技术重点实验室，苏州 215009;2 南京医科大学 基础医学院，南京211166

乳腺癌是最常见且致死性较高的妇科肿瘤之一，其易转移和侵袭的特点严重影响女性患者的生存期和生活质量[1]，因此寻求安全有效地抗乳腺癌转移的药物显得尤为迫切。中药刺五加已被证实具有抗心肌缺血、抗疲劳、抗辐射以及抗多种肿瘤细胞的药理作用[2，3]，其中刺五加皂苷是其重要的活性成分。近年来，越来越多的研究指出，刺五加皂苷具有抗肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7 以及胃癌细胞SGC-7901 的作用[4，5]，但通过文献研究和实验结果发现，单独使用刺五加皂苷B 或E 直接杀伤乳腺癌细胞MDA-MB-231 细胞的作用不强。最新研究指出，有氧糖酵解[6，7]是肿瘤细胞的主要供能方式，同时也为肿瘤提供了一个酸性环境，为其增殖、迁移和侵袭提供了能量保障，因而能够抑制肿瘤细胞糖酵解的药物对于抑制肿瘤细胞迁移和侵袭具有重要意义。本研究初步探究了刺五加皂苷B 和E 的复合物，对人乳腺癌增殖、迁移、侵袭和糖酵解相关蛋白的影响，以期为刺五加皂苷B 和E 复合物的开发利用及寻求抗乳腺癌转移药物的研发提供实验依据。

1 实验材料

1.1 细胞株

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231 细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 药品与试剂

刺五加皂苷B（纯度≥98%，批号：wkq16060805）和刺五加皂苷E（纯度≥98%，批号：wkq16040502），均为四川维克奇生物科技有限公司产品；两种皂苷以1∶1 混匀，成为复合物B/E，溶解于DMSO 溶液中，使用时稀释到所需浓度。CCK8 试剂盒（批号：GB707，日本同仁公司）；胎牛血清（批号：11H228，上海依科赛公司）；DMEM 培养基（批号：8117167，美国Gibco公司）；Matrigel基底膜基质（批号：6238005，美国BD 公司）；瑞士吉姆萨染液（批号：183631，武汉赛维尔生物科技有限公司）；HK、PFK-2、Glut-4 和β-actin 一抗（美国CST 公司）；PVDF膜（美国Millipore 公司）；兔二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；所用试剂均为化学纯；水为纯化水。

1.3 仪器

3110 型CO2培养箱（美国Thermo 公司）；Multiskan FC 多功能酶标仪（美国Thermo 公司）；GelDoc 2000 凝胶成像系统（美国Bio-RAD）。

2 实验方法

2.1 CCK-8 法检测刺五加皂苷B/E 对MDAMB-231 细胞增殖活力的影响

采用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养乳腺癌MDA-MB-231 肿瘤细胞，将处于对数生长期的细胞消化后离心、计数，将细胞浓度调整至5×105/mL，均匀接种每孔200 μL 悬液于96 孔细胞培养板中，置37 ℃、含5%的CO2培养箱继续培养，待细胞培养12 h 贴壁后，各孔分别加入不同剂量的刺五加皂苷B/E（25、50、100、200、400、800 μmol·L-1）和对照溶剂组（DMSO）继续孵育24 h，每组设置6 个复孔，孵育完成后，每孔加入10 μL CCK8 试剂，置37 ℃含5%的CO2培养箱继续培养2 h，取出细胞培养板于酶标仪450 nm 波长下检测其吸光度值。

2.2 细胞划痕法检测刺五加皂苷B/E 对MDAMB-231 细胞迁移的影响

取对数生长期的肿瘤细胞，以每孔3×105个接种于6 孔细胞培养板中，加入培养基使每孔的总体积为2 mL。6 孔板置于培养箱中培养24 h，待细胞生长贴壁后弃去上清液，无菌PBS 清洗细胞两次，清洗后用白色的10 μL 枪头沿每孔的中线垂直划痕。划痕结束后，无菌PBS 继续清洗两次，加入2 mL 新鲜含药的1%胎牛血清培养基。实验共分4 个组：空白组、刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 种浓度组，每组设置3 个平行孔。24 h 后分别于100 倍显微镜下拍照。通过测量剩余无细胞面积与初始划痕伤口面积的百分比来确定伤口愈合效果。

2.3 Transwell 法检测刺五加皂苷B/E 对MDAMB-231 细胞侵袭能力的影响

采用DMEM 培养基，对去生长因子的Matrigel以1∶4 进行稀释混匀，均匀铺被于Transwell 上室的膜表面，待铺被完成后小心将小室置于37 ℃培养箱中使其凝固。取5×103个MDA-MB-231 肿瘤细胞接种在Transwell 小室的上室。实验共分4 个组：空白组、刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 种浓度组，各组分别加入相应的含药培养基200 μL，每组设置3 个平行孔。Transwell 下室加入含有15%小牛血清的DMEM 培养基500μL，整个体系置于37℃培养箱中继续培养24 h，使药物充分作用于细胞。24 h后用棉签小心将Transwell 上室中没有迁移的细胞拭去，取出上室底部的膜，采用4%多聚甲醛固定10min，以瑞士吉姆萨染液进行染色30min，之后置于载玻片上，在200 倍显微镜下随机选5 个视野进行拍照、计数，计算每个视野的平均值。

2.4 乳酸试剂盒检测细胞上清液中乳酸含量

取对数生长期的MDA-MB-231 肿瘤细胞，以2×105个接种于6 孔细胞培养板中（培养体系共计2 mL），于37 ℃培养箱中培养24 h，进行贴壁，贴壁后小心吸去细胞培养基，空白组加入不含药物的完全培养基2 mL，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 种浓度组分别加入相应的含药培养基2 mL，每组设置3 个平行孔。细胞经药物处理24 h 后，收集细胞上清液，按乳酸试剂盒说明书进行操作，即设置标准品0、4、8、16、32 和64 nmol·mL-1浓度，用于制备试剂盒标准曲线，同时设置各给药组，精密吸取细胞上清液10 μL，加于96 孔板后，加入样品稀释液使终体积为50 μL。各孔再加入相应的乳酸工作液和酶工作液，终体积为100 μL，振荡混匀后，室温避光孵育30 min，以空白孔调零，450 nm 波长下检测吸光度值。按照公式r=n/V 计算相应的乳酸浓度

[r 为检测孔中乳酸浓度；n 为待检测孔的乳酸量（nmol），按乳酸标准曲线计算得到；V 为加入孔样本的体积（μL）]。

2.5 PCR 检测细胞糖酵解相关基因的表达

取对数生长期的MDA-MB-231 肿瘤细胞，以2×105个接种于6 孔细胞培养板中（培养体系共计2mL），于37 ℃培养箱中培养24 h，进行贴壁，贴壁后小心吸去细胞培养基，空白组加入不含药物的培养基2 mL，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 种浓度组分别加入相应的含药培养基2 mL，每组设置3 个复孔。细胞经药物处理24 h 后弃去培养基，采用无菌PBS清洗3 次，加入TRIzol 提取液充分提取细胞中的总RNA。以500ng 总RNA 为模板逆转相应的cDNA，在荧光酶标仪上进行相应的PCR 反应。实验结果以2-△△Ct法计算基因表达量，以β 肌动蛋白（β-Actin）作为内参基因，计算已糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）、葡萄糖转运体4（Glut4）基因的相对表达量。

引物序列为HK：正向：5’-CAACATTCTCATCGATTTCACGAA-3’，反向：5’-GATGGCACGAACCTGTAGCA-3’；PFK2:正 向：5’-ACTGAAGGGCTCCCACGGCA-3’，反 向：5’-GGCCGCAGTTTCAGCCACCA-3’；Glut4：正向：5’-CTGCACTCCTTCTTCCCTTT-3’，反向：5’-GCCTGCACTTGAGGAGGATTT-3’；β-Actin：正向：5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’，反向：5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’。

2.6 Western Blot 法检测糖酵解相关蛋白的表达

取对数生长期的MDA-MB-231 肿瘤细胞，以2×105个接种于6 孔细胞培养板中（培养体系共计2 mL），于37 ℃培养箱中培养24 h，贴壁，贴壁后小心吸去细胞培养基，空白组加入不含药物的培养基2 mL，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 种浓度组分别加入相应的含药培养基2 mL，每组设置3个复孔。空白组加入相应的DMEM 培养基，各处理组加入相应的含药培养基各2 mL，于37 ℃培养箱中继续培养24 h。培养结束后，收集各孔细胞，采用RIPA 细胞裂解液进行裂解。BCA 法进行蛋白定量，将蛋白与上样缓冲液按比例混合后蒸煮制备蛋白样品，制备结束进行制胶和SDS-PAGE 电泳。电泳后转膜1.5 h，脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗HK、PFK、Glut4 和β-Actin（1∶1 000 稀释）过夜。次日，洗膜后加入二抗（1∶2 000 稀释）孵育1.5 h，TBST 洗膜4 次，每次10 min，于凝胶成像系统上曝光，使用ImageJ 1.45s 软件作灰度分析。以目标蛋白与内参β-Actin灰度值的灰度比值，作为目标蛋白的相对表达水平。

2.7 统计方法

本研究结果采用Graph Pad Prism 5 软件进行作图分析，采用SPSS 21.0 软件对数据进行单因素方差分析，采用Student-Newman-Keuls post hoc 检验作组间比较。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 刺五加皂苷B/E 对MDA-MB-231 细胞增殖活性的影响

采用CCK8 法检测不同浓度刺五加皂苷B/E 对乳腺癌细胞MDA-MB-231 细胞增殖抑制作用。药物处理24h 后，与空白组相比，刺五加皂苷B/E（25、50、100、200 μmol·L-1）组的吸光度值均未发现显著降低，差异无统计学意义（P＞0.05），刺五加皂苷B/E（400、800 μmol·L-1）组吸光度发生明显降低，原因并不是刺五加皂苷B/E 对肿瘤细胞的杀伤作用，而是由于药物浓度影响了细胞的生存率，表明刺五加皂苷B/E 并不能直接抑制MDA-MB-231 乳腺癌细胞的增殖。见图1。

3.2 刺五加皂苷B/E 对MDA-MB-231 细胞迁移能力的影响

鉴于刺五加皂苷B/E 在25、50、100、200 μmol·L-1的浓度下剂量不具有直接杀伤肿瘤细胞的作用，因此选取50、100、200 μmol·L-13 种浓度，研究刺五加皂苷B/E 对MDA-MB-231 肿瘤细胞迁移能力的影响。结果显示，与空白组相比，刺五加皂苷B/E（100、200 μmol·L-1）组细胞迁移距离明显减少，且差异具有统计学意义（P＜0.01），见图2。结果表明，刺五加皂苷B/E 具有潜在的抑制MDA-MB-231 乳腺癌细胞迁移的作用。

3.3 刺五加皂苷B/E 对MDA-MB-231 细胞侵袭能力的影响

Transwell 实验结果显示，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3种浓度组侵袭的MDA-MB-231 乳腺癌细胞数量均明显减少，且与空白组相比差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见图3。结果表明，刺五加皂苷B/E 具有抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231 细胞侵袭的作用。

3.4 刺五加皂苷B/E 对MDA-MB-231 细胞培养上清液中乳酸含量的影响

以乳酸试剂盒对药物处理后的细胞上清液进行检测，结果显示，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 种浓度组均能够减低MDA-MB-231 细胞培养上清液中乳酸的含量，且与空白组相比差异具有统计学意义（P＜0.01），见图4。结果表明，刺五加皂苷B/E抑制MDA-MB-231 乳腺癌细胞迁移和侵袭的作用，可能与降低乳腺癌细胞乳酸分泌有关。

3.5 刺五加皂苷B/E 乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞HK、PFK 及Glut4 基因mRNA 表达的影响

PCR 结果显示，刺五加皂苷B/E（50、100、200μmol·L-1）3 种浓度组均能够降低MDA-MB-231 乳腺癌细胞内有氧糖酵解相关HK、PFK 及Glut4 三种基因mRNA 的表达水平，且与空白组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见图5。

3.6 刺五加皂苷B/E 对MDA-MB-231 细胞糖酵解相关蛋白的影响

Western Blot 实验结果显示，与空白组相比，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 种浓度组使糖酵解相关蛋白HK、PFK 及Glut4 表达水平明显降低，见图6。PCR 和Western Blot 的结果均表明，刺五加皂苷B/E 抑制MDA-MB-231 乳腺癌细胞迁移和侵袭作用的机制可能与抑制乳腺癌细胞有氧糖酵解相关。

4 讨论

目前对女性乳腺癌的研究普遍认为，乳腺癌细胞易转移、侵袭的特性极大地增加了患者的死亡率。Hanahan D 等[8]认为，肿瘤细胞代谢异常，即使氧气充足，肿瘤细胞也能够优先采用糖酵解，而非线粒体氧化磷酸化为其生长、转移、侵袭等恶性生物学行为提供能量；同时糖酵解过程中产生的乳酸也为肿瘤细胞提供了一个酸性环境，为其转移、侵袭提供重要的环境支撑。对于侵袭能力较强的乳腺癌MDA-MB-231细胞，其糖酵解相关的蛋白表达是明显上调的、且其明显呈现酸性微环境，提示抑制MDA-MB-231 肿瘤细胞糖酵解过程可能成为抑制该细胞转移、侵袭的重要方式。

鉴于本课题组前期预实验发现，采用刺五加皂苷B 或E 单独处理MDA-MB-231 及MCF-7 细胞，即使浓度很高均不能够抑制这些肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭。试验选取了刺五加苷B/E 混合物的3种浓度（50、100、200 μmol·L-1）进行后续的迁移和侵袭的研究，结果发现，刺五加皂苷B/E 能够明显抑制MDA-MB-231 细胞的迁移和侵袭，且具有一定的剂量依赖性。

本研究发现，刺五加皂苷B/E 能够剂量依赖性的抑制肿瘤细胞乳酸的分泌，提示刺五加皂苷B/E对肿瘤细胞糖酵解具有一定的抑制作用。Glut4 是细胞表面重要的葡萄糖转运体，已有研究指出，恶性程度越高的肿瘤细胞表面Glut4 的表达水平也越高[9]。本实验表明，刺五加皂苷B/E 能够剂量依赖性的抑制肿瘤细胞Glut4 的表达，进而抑制肿瘤细胞葡萄糖的摄入。在糖酵解途径中，HK 和PFK 是两个重要的限速酶，调控肿瘤细胞糖酵解的过程，研究结果表明，刺五加皂苷B/E 也能够剂量依赖性的抑制HK 和PFK 的表达，提示刺五加皂苷B/E 抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的机制可能与抑制肿瘤细胞糖酵解相关的Glut4、HK、PFK 和减少乳酸分泌有关。

综上所述，刺五加皂苷B/E 具有抑制乳腺癌MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭的作用，其作用机制可能是调控肿瘤细胞糖酵解相关的蛋白Glut4、HK、PFK 的表达和抑制乳酸分泌相关，这提示刺五加皂苷B/E 可能成为一种潜在的糖酵解抑制剂。