一株致多发性浆膜炎猪源肠外E.coli的分离与鉴定

蒋增海，王成龙，宋 浩，邓同炜，唐光武，夏艳勋

(1.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046；2.河南省猪病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046)

肠外致病性大肠杆菌(ExtraintestinalPathogenicEscherichiacoli,ExPEC)是一类能引起人和动物肠外组织感染的重要人畜共患病病原，可致使不同宿主发生脑膜炎、败血症、泌尿道感染和呼吸道感染[1]。动物源ExPEC 具有人畜共患的特性，给人类的健康造成了潜在的威胁[2]。有研究表明，ExPEC的抗生素耐药性明显高于其它菌群，50%以上菌株属多重耐药菌株，许多菌株已演化成超级耐药细菌，较难选择有效的抗生素对该类菌群引起的疾病进行防控[1]。目前，猪大肠杆菌病在临床上的病型，主要分为黄痢型、白痢型和水肿型[3]，致多发性浆膜大肠杆菌病很少报道。2019年5月份，河南省南阳市某自繁自养的小型猪场，断奶后的保育仔猪发病，表现为精神不振、消瘦、被毛粗乱、腹式呼吸、拉稀等症状，笔者采集病料，通过细菌分离、鉴定和药敏试验，获得1株致多发浆膜炎猪肠外致病性大肠杆菌，药敏试验表明，该分离菌株十分耐药，仅对少数药物敏感，猪群经过敏感药物治疗，病情好转，本次诊治经验能为猪场兽医临床提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

样品来自发病的仔猪。保育仔猪存栏110多头，断奶后陆续发病，发病率约为20%-30%，发病已有1周时间，死亡4头仔猪，发病后用阿莫西林、环丙沙星、泰乐菌素拌料，均不见效，病情越来越严重。

1.2 材料与试剂

胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)购自美国BD公司，麦康凯琼脂购自北京奥博星生物有限公司，MH琼脂、MH肉汤购自英国Oxoid公司；肠杆菌科细菌生化编码鉴定管 CYZ-15e和配套试剂均购自杭州滨和微生物试剂有限公司；10×EX Taq PCR Buffer(Mg2+ Plus)、dNTP Mixture、TaKaRa Ex Taq 购自TaKaRa公司；BM2000 DNA Marker购自北京博迈德生物基因技术有限公司；各种药敏片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；健康昆明小鼠由河南牧业经济学院动物房购置。

1.3 细菌分离

先将剪刀、镊子火焰灼烧消毒，使用75%酒精棉球擦拭心脏、肝脏表面，点燃酒精棉球，在肝脏、心脏表面引火自燃消毒，保证无杂菌污染，剪去肝脏表面组织，取深部组织，剪开心脏，灭菌棉签取心血，分别稀释划线接种于加有一定量血清和V因子的胰蛋白酶胨大豆琼脂平板，37℃恒温培养12h-24h，挑取典型菌落，再接种麦康凯琼脂平板，进一步纯化2-3代。

1.4 染色镜检

取洁净玻片一张，在玻片中央滴一滴蒸馏水，挑取纯化的单菌落，与蒸馏水混匀，自然干燥后，火焰固定，再使用革兰氏快速染色液，按照说明书染色，油镜下观察细菌形态 。

1.5 生化试验

进行生化试验，并根据生化试验的结果，按照肠杆菌科细菌生化鉴定编码手册要求，检索细菌鉴定的结果。

1.6 PCR鉴定

参照文献[4],合成一对大肠杆菌PCR扩增特异性引物，其序列为E.coli-1：5′-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3′,E.coli-2：5′-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3′，扩增大小约为264 bp特异性片段。水煮沸提取细菌的DNA模板。按照TaKaRa Ex Taq试剂的说明书，进行分离菌株的PCR扩增；反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，总共30个循环；最后72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物由1%琼脂糖进行电泳，然后由DAN凝胶成像系统分析电泳结果。

1.7 小鼠致病性试验

健康昆明小鼠10只，随机分为两组，每组各5只，一组为实验组，一组为对照组。实验组，先将分离菌株培养的新鲜菌液，进行一定稀释，每只小鼠腹腔接种稀释菌液0.2mL,同时进行细菌平板计数。对照组，每只小鼠腹腔接种PBS 0.2 mL。

1.8 药敏试验

以大肠杆菌 (ATCC25922)为质控菌株，按照世界卫生组织(WHO)推荐的K-B法进行药敏试验，参照文献[5-6]判读分离菌株对各种药物的耐药情况。

2 结果

2.1 病猪的主要病理变化

送检4头病猪的剖解病变一致，颌下淋巴结肿大、出血，腹股沟淋巴结肿大、出血(图1)，肠系膜淋巴结肿大、出血，肺脏充血、出血；胸、肺粘连，心包增厚，心外膜表面覆盖有大量纤维素性物质，呈“绒毛心”(图2)；肝周炎，肝脏表面覆盖大量纤维素性物质，小肠表面覆盖大量纤维素性物质(图3)，表现为多发性浆膜炎。

图1 腹股沟淋巴结肿大、出血

图2 心包增厚，“绒毛心”

图3 心、肝和肠覆盖大量纤维素性物质

2.2 细菌分离结果

无菌采集肝脏或者心血，接种于加有一定血清和V因子的TSA平板，37℃培养12h，生长为圆形、湿润、半透明、凸起、大小约为1-2mm的菌落，菌落形态一致，眼观比较纯(图4)；挑取典型的菌落，接种于麦康凯琼脂平板，进一步纯化，生长为圆形、粉红色、湿润的菌落。

2.3 染色镜检结果

采用革兰氏染色后，显微镜下观察，呈可见革兰氏阴性、中等大小、无芽孢的短小杆菌(图5)。

图4 分离菌株在TSA平板的菌落形态

图5 分离菌株染色镜检形态

2.4 生化试验结果

按照厂家说明书操作，生化试验结果如表1所示，根据肠杆菌科细菌生化鉴定编码册检索结果，表明分离菌株为大肠埃希菌。

表1 分离菌株生化试验结果

注：+:阳性；-:阴性；○+:产酸产气

2.5 PCR鉴定结果

使用大肠杆菌特异性PCR扩增引物，对分离菌株进行PCR鉴定。PCR扩增结果显示，分离菌株与大肠杆菌阳性对照扩增结果一致，均扩增出264 bp条带，而去离子水作为阴性对照，未扩增出条带(图7)，表明分离菌株为大肠杆菌。

图6 分离菌株PCR鉴定结果注：M：DNA分子量标准(BM2000)；1、2：分离菌株；3、阴性对照

2.6 小鼠致病性试验结果

细菌平板计数结果表明，每只小鼠接种分离菌株的菌量为4.5×107CFU。接种后12-18h 内，实验组所有小鼠均死亡；对照组无死亡，全部健康。将死亡的小鼠，无菌采集心血或者肝脏，接种麦康凯琼脂平板，能分离出大肠杆菌。本试验表明,分离大肠杆菌对小鼠具有致病性，说明该菌株不是继发感染菌株或者污染的杂菌。

2.7 药敏试验

药敏结果显示,分离菌株对阿米卡星、多粘菌素、美罗培南、亚胺培南敏感，对卡那霉素中介，对庆大霉素、恩诺沙星、强力霉素、氨苄西林、磺胺类药物、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑啉等均耐药。

表1 药敏试验结果

注：S:敏感；I:中介；R:耐药

3 讨论

送检病猪表现为消瘦、生长缓慢、腹式呼吸等症状，剖解病变为心包腔、胸腔和腹腔等内脏组织表面充满大量纤维素性物质，很容易将其误诊为副猪嗜血杆菌病。采用加有一定量血清和V因子的胰蛋白酶大豆琼脂平板分离细菌，其目的是判断本病是否由副猪嗜血杆菌引起。细菌分离结果分离到圆形、半透明、生长一致、外观比较纯的大肠杆菌菌落，无副猪嗜血杆菌菌落生长。根据临床经验，副猪嗜血杆菌生长缓慢，在TSA平板培养基上，37 ℃恒温培养12 h左右，不可能生长为1-2 mm大小的菌落。猪链球菌也可以导致浆膜炎型[7]，但是链球菌在TSA平板上，生长24-48 h，菌落针尖大小，约为0.5-1 mm，明显小于大肠杆菌菌落。最后，根据病原菌分离鉴定和小鼠致病性试验，将本次送检病猪诊断为猪大肠杆菌病。试验表明，肠外致病性大肠杆菌，能够导致猪发生多发性浆膜炎，尤其肝脏覆盖纤维素性物质，与以前文献报道的结果一致[8]。

药敏试验结果表明，该大肠杆菌临床分离株耐药性十分严重，呈严重多重耐药性，特别是对头孢菌素类药物都耐药，如果该菌株，通过食物或者饮水感染人类，造成头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑啉等治疗无效，严重威胁人类健康；对兽医临床上的常用药物如氨苄西林、庆大霉素、恩诺沙星、强力霉素、磺胺类药物等均耐药，并且对临床上禁用药氯霉素也耐药，推测对临床上常用的氯霉素的同类药氟苯尼考也可能会耐药；仅仅对美罗培南、亚胺培南、阿米卡星、多粘菌素敏感。

阿米卡星、美罗培南、亚胺培南属于医用药物，本次病例，选用硫酸黏菌素注射液治疗，按照一次量，每1 Kg体重，肌内注射2-4 mg，每天1次，连用3天后，病情得到好转。这表明，目前兽医临床上细菌耐药性问题已经十分严重，猪病发生后，采集病料，分离病原菌，进行药敏试验，十分必要。