利用CRISPR-Cas9和Cre/loxP系统删除34个非必需基因构建L-苏氨酸生产菌

丁志祥，胡晓清，柳亚迪，王小元*，3

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122；3.江南大学 国际食品安全联合实验室，江苏 无锡214122）

L-苏氨酸是8种必需氨基酸之一，被广泛应用于食品、饲料以及医药等领域，有着广阔的市场前景[1]。L-苏氨酸的生产方式主要是通过微生物发酵，并且大肠杆菌由于发酵周期短，遗传背景清晰，便于基因改造，而成为了L-苏氨酸生产的主要菌株[2]。大肠杆菌生产L-苏氨酸涉及糖酵解、TCA循环和L-苏氨酸生物合成途径，见图1。利用分子生物学技术来提高L-苏氨酸的产量已成为热门方向。thrA、thrB和thrC这3个基因都位于操纵子thrABC上，分别编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶。将thrA的第1 034位碱基由C突变为T可解除苏氨酸对其反馈抑制[1]。随着操纵子转录水平的提高，ThrA、ThrB和ThrC 3种蛋白质的数量增加，从而使更多的碳流流向L-苏氨酸合成途径，L-苏氨酸产量得以提高。如将含有诱变操纵子ThrA*BC的重组质粒PVIC40引入到脱敏大肠杆菌菌株MG442中时，L-苏氨酸产量从8 g/L增加到18.4 g/L[3]。胞内合成的L-苏氨酸经过由基因rhtA、rhtB、rhtC编码的3种输出蛋白质运送至胞外，但只有rhtC编码的RhtC对L-苏氨酸具有专一性[2]。由于赖氨酸、蛋氨酸或甘氨酸的生物合成被这些突变体阻断，lysA、metA或tdh缺失突变体的L-苏氨酸产量显著增加[4]。将糖酵解通量改向戊糖磷酸途径可减少乙酸积累并产生更多的NADPH，也可以增加L-苏氨酸产量[5]。有研究表明，操纵L-苏氨酸生物合成和旁路代谢途径可提高L-苏氨酸的产量[6-8]。在大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成L-苏氨酸的过程中，并不需要所有的基因发挥其功能，而这些基因仍然会利用碳源进行转录，且翻译成相关蛋白质。作者所在实验室有一株从土壤中筛选得到的高产L-苏氨酸的大肠杆菌TWF001[1]，其基因组与野生型MG1655相比缺少puuE到ynaI之间的DNA分子片段。大肠杆菌基因组上puuE到ynaI之间的DNA分子长度为30.372 kb，包含pspFABCDE、ycjMNOPQRSTUV、ycjWXF3个操纵子和puuE、ymjB、ompG、tyrR、tpx、ycjG、mpaA、ymiC、ycjY、ycjZ、mppA和ynaI12个单基因，其中pspFABCDE操纵子编码的噬菌体休克蛋白（Psp）系统负责修复内膜的损坏[9]；ycjMNOPQRSTUV操纵子和ompG被认为可能是大肠杆菌中的一种未知碳水化合物的潜在分解代谢途径。近期也有研究表明，ycjQRS编码的蛋白质可以将D-古洛糖苷转化为D-葡萄糖苷[10]；由puuE基因所编码的GABA转氨酶可以将GABA转化为琥珀酸半醛，通过敲除puuE基因可以提高GABA的产量[11]；tyrR编码的TyrR蛋白是L-色氨酸生物合成和转运相关基因的调节因子[12]；ycjG、mpaA、ycjYZ和mppA编码的蛋白质可以降解肽聚糖补充氮源来抵抗氮源饥饿环境[13]；而ycjWXF、ymjB、tpx、ymiC和ynaI基因的功能尚不清楚。通过对大肠杆菌基因组进行精简，可以达到减少碳源损耗的目的。

图1 大肠杆菌中L-苏氨酸的生物合成途径Fig.1 Biosynthesis pathway of L-threonine in E.coli

作者以大肠杆菌MG1655为出发菌株，结合CRISPR-Cas9技术[14]和位点特异性重组系统Cre/loxP[15]进行基因组大片段的敲除，构建了MG1655ΔpuuE-ynaI，将携带L-苏氨酸操纵子的质粒pFW01-thrA*BC转入突变株中，进行摇瓶发酵，结果表明缺失puuE到ynaI之间的DNA片段可以有效增加L-苏氨酸的产量。并且发现在突变株中加强rhtC的表达，相比于加强rhtA的表达，L-苏氨酸的增加更为明显。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 菌株与培养基出发菌株：大肠杆菌MG1655，作者所在实验室保藏，相关突变株和质粒见表1。大肠杆菌细胞在37℃或30℃的Luria Bertani（LB）培养基（5 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨和10 g/L氯化钠）中以200 r/min的旋转振荡生长，LB固体培养基需另加16 g/L琼脂粉。在培养和筛选过程中根据需要添加诱导剂或抗生素：异丙基硫代半乳糖苷（IPTG：0.5 mmol/L）、阿拉伯糖（30 mmol/L）、5-氯-2（2′，4′-二氯苯氧基苯酚）（100 mg/L）、卡那霉素（50 mg/L）、壮观霉素（50 mg/L）、氨苄霉素（50 mg/L）。L-苏氨酸的生产水平和生长特性通过发酵法进行测定，种子培养基为LB培养基。摇瓶发酵培养基：30.0 g/L葡萄糖，2.0 g/L酵母粉，25.0 g/L（NH4）2SO4，2.0 g/L 柠 檬 酸，7.46 g/L KH2PO4，2.0 g/L MgSO4·7H2O，5 mg/L FeSO4·7H2O，5 mg/L MnSO4·4H2O，20 g/L CaCO3，pH 6.8。115℃灭菌15 min[17]，上述试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

表1 本研究中使用的菌株和载体Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 实验设备回旋式摇床（HYG-A）：上海知楚公司；液相色谱仪（Agilent 1260）：美国Agilent有限公司；核酸蛋白定量仪（GZNOVA）：英国Biochrom公司；实时荧光定量PCR仪（StepOnePlus）：美国Applied Biosystems公司；还原糖测定仪（SBA-40）：山东科学院生物研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 基因重组菌的构建本研究所用的引物见表2。引物主要根据大肠杆菌MG1655基因组序列设MG003菌株是用CRISPR-Cas9和Cre/loxp系统相结合的方法敲除基因puuE到ynaI之间的整个DNA片段。基因编辑进程中所用到的质粒图谱见图2。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

图2 本研究所用到的质粒pCas、pTargetF、pKD-Cre、pFW01-thrA*BC、pFW01-thrA*BC-rhtA和pFW01-thrA*BC-rhtC的图谱Fig.2 Maps of different plasmids pCas，pTargetF，pKDCre，pFW01-thrA*BC，pFW01-thrA*BC-rhtA and pFW01-thrA*BC-rhtC used in this study

1）MG001（MG1655puuE：：loxP）的构建 将loxP位点的13 bp反向重复序列设计在上下游同源臂的引物重叠区。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术首先在puuE的上游区插入loxP位点，上游同源臂和下游同源臂分别用引物loxP-puuEf1/loxPpuuEf2和loxP-puuEr1/loxP-puuEr2进行扩增，然后将上下游同源臂通过重叠PCR的方法连接成loxP-puuE打靶片段。质粒pTargetF-loxP-puuE是以原始质粒pTargetF为模板，用引物sgRNA-puuEF和T-sgRNA-R扩增得到线状的pTargetF-loxPpuuE片段，再通过自连成环状质粒pTargetF-loxPpuuE，引物T-puuE-F和T-sgRNA-R用来验证质粒的正确性。然后将构建好的100 ng质粒pTargetF-loxP-puuE和500 ng打靶片段loxP-puuE电转化到80μL的含有pCas的MG1655的感受态中，转化子通过含有卡那霉素和壮观霉素的LB双抗平板进行筛选（pCas和pTargetF分别含有对卡那霉素和壮观霉素具有抗性的基因），当在30℃烘箱中培养4 h后，用引物loxPf和loxP-puuEr2验证重组菌株的正确性，pTargetF-loxP-puuE通过加入IPTG去除，因为IPTG可以激活质粒pCas中控制sgRNA-PMB1表达的lacIq启动子，sgRNA-PMB1可以切割质粒pTargetF-loxP-puuE的PMB1片段。通过在42℃下过夜培养去除温敏型质粒pCas。

2）MG002（MG1655puuE：：loxP，ynaI：：loxP）的构建 采用1.2.1的方法在ynaI的下游区插入loxP位点，上游同源臂和下游同源臂分别用引物loxPynaIf1/loxP-ynaIf2和loxP-ynaIr1/loxP-ynaIr2进行扩增，然后将上下游同源臂通过重叠PCR的方法连接成loxP-ynaI打靶片段。质粒pTargetF-loxP-ynaI是以原始质粒pTargetF为模板，用引物sgRNAynaI-F和T-sgRNA-R扩增得到线状的pTargetFloxP-ynaI片段，再通过自连成环状质粒pTargetFloxP-ynaI，引物T-ynaI-F和T-sgRNA-R用来验证质粒的正确性，后续的步骤与1.2.1相同。

3）MG003（MG1655ΔpuuE-ynaI：：loxP）的构建通过1.2.2的方法，成功构建了含有两个同向loxP位点的MG002菌株，将质粒pKD-Cre46电转入MG002的感受态中，用含有氨苄抗性的LB平板进行筛选，转化子再通过加入阿拉伯糖诱导Cre重组酶的表达，使两个loxP位点之间发生重组，loxPpuuEf1和loxP-ynaIr2引物用来验证转化子的正确性。再通过42℃过夜培养去除pKD-Cre46得到所需的目的菌株MG003，菌株构建示意图见图3。UpuuE和DpuuE分别表示puuE基因的上下游同源臂，UynaI和DynaI分别表示ynaI基因的上下游同源臂。

图3 大片段puuE-ynaIDNA片段敲除策略Fig.3 A strategy for generating deletion of large puuEynaIDNA fragment

1.2.2 摇瓶发酵先将冻干管菌液划线于无抗的LB固体培养基上活化菌株，置于37℃的培养箱中过夜培养，再用接种环挑菌接种于装有5 mL LB液体培养基的试管中，37℃、200 r/min培养4 h，接着转接到二级种子摇瓶培养基中，初始OD600为0.1，37℃、200 r/min培养4 h，最后将上述培养液转接到发酵培养基中，初始OD为0.2，37℃、200 r/min培养36 h，每隔6 h取一次样。

1.2.3 发酵参数的测定

1）生物量的测定 发酵菌株的生物量通过紫外分光光度计进行测定，用1 mol/L的盐酸稀释至OD600=0.1～1之间。

2）葡萄糖质量浓度的测定 葡萄糖质量浓度通过SBA-40还原糖测定仪进行测定，待仪器定标以后，取1 mL发酵液在12 000 r/inm转速下离心2 min，将上清液用去离子水稀释100倍，混匀，测定葡萄糖质量浓度。

3）pH的测定 取1 mL发酵液在12 000 r/min离心2 min，将上清液置于pH计探头下，显示数值即为发酵液的pH。

4）氨基酸质量浓度的测定 样品的前处理：取1 mL发酵液在12 000 r/min下离心2 min，取上清液50μL与950μL 5%的三氯乙酸混匀，置于4℃冰箱2 h以上，待上清液蛋白质沉淀后，12 000 r/min离心15 min，然后用0.22μm的水相针式滤膜过滤上清液，过滤后的上清液即为处理好的待测样品。

使用高效液相色谱法测定氨基酸的质量浓度，方法为邻苯二甲醛柱前衍生化法[18]。仪器为Agilent1200超高效液相色谱仪，色谱柱为ThermoODS-2HYPERSILC18 column（250 mm×4.0 mm，USA）。流动相：水相（3.01 g无水乙酸钠溶解于超纯水中，200μL三乙胺，5 mL四氢呋喃，用水定容至1 L，调pH至7.2）和有机相（3.01 g无水乙酸钠溶解于200 mL超纯水中，调pH至7.2，400 mL HPLC乙腈，400 mL HPLC甲醇）。UV检测波长338 nm，流速1 mL/min，柱温40℃。

5）乙酸质量浓度的测定 样品的前处理：取1 mL的发酵液在12 000 r/min下离心2 min，取上清液300μL与300μL的去离子水混合均匀，12 000 r/min离心30 s，置于80℃水浴锅15 min以上，待上清液蛋白质变性后，12 000 r/min再离心15 min，然后用0.22μm的水相针式滤膜过滤上清液，过滤后的上清液即为处理好的待测样品。

采用高效液相色谱法测定乙酸质量浓度，仪器为Agilent1200超高效液相色谱仪，色谱柱为aminex HPX-87H column（300 mm×7.8 mm），流动相为0.005 mol/L的稀硫酸，流量设置为0.6 mL/min，柱温维持在50℃，紫外检测波长为210 nm。

1.2.4 基因的转录水平分析采用实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）对不同大肠杆菌株中ppc、pck、gltA、aspC、aceA和aceB基因的mRNA进行定量分析。采用RNA提取试剂盒（中国北京，BioFlux）从对数生长中期的大肠杆菌细胞中提取总RNA。用核酸定量仪测定RNA的浓度，用4×gDNAwiper Mix（中国南京，Vazyme）从RNA样品中去除残留的DNA。再用5×HiScriptⅡqRTSuperMixⅡ（中国南京，Vazyme）将RNA反转录成cDNA。采用ABIStep OneRT-PCR系统（美国加利福尼亚州圣马特奥市应用生物系统）和ChamQTMUniversal SYBR®qPCR Mastet Mix（中国南京，Vazyme）进行RT-PCR。表2列出了本研究中使用的引物，采用RT-PCR程序为：95℃，30 s；95℃，10 s；60℃，30 s；40个循环。根据周期阈值定量目标mRNAs的相对丰度，该阈值定义为获得背景以上荧光信号所需的周期数，并根据2-ΔΔCT公式进行计算[19]。为了使结果标准化，采用16S rRNA相对丰度作为内部标准控制。

1.2.5 数据分析方法本研究中单项方差分析（oneway analysis of variance）被应用于数据分析[20]。单项方差分析也是一种最简单的方差分析方法，以Excel为分析工具，OD600、葡萄糖消耗速率、L-苏氨酸的合成、乙酸的形成和基因的转录水平之间的差异用单项方差分析得出p值，p小于0.05，表明显著的差异。

2 结果与讨论

2.1 大肠杆菌MG655基因组中34个非必需基因的删除对菌株生长无明显影响

从基因puuE的起始密码子到ynaI的终止密码子共有30.372 kb，用传统的Red同源重组的基因编辑方法无法敲除，已有文献报道位点特异性重组系统Cre/loxP可以进行大片段的敲除[21]，但通过普通的Red同源重组在基因组中引入两个loxP位点并不容易。作者第一次将CRISPR-Cas9技术和位点特异性重组系统Cre/loxp结合进行大肠杆菌大片段DNA分子的敲除，因为CRISPR-Cas9基因编辑技术相对于传统的Red同源重组有着更高的编辑效率。首先利用CRISPR-Cas9技术在puuE的上游区插入第一个loxP位点，采用1.2.1（1）验证方法，正确插入loxP位点条带大小为313 bp，见图4泳道1。野生型无loxP结合位点，见泳道2。然后在ynaI的下游区插入第二个loxP位点，采用1.2.1中（2）验证方法，正确插入loxP位点条带大小为306 bp，见泳道3，野生型见泳道4。最后转入质粒pKDCre46，使两个loxP位点之间发生重组，采用1.2.1中（3）的验证方法，突变株条带大小为554 bp（见泳道5），野生型有30 kb左右，无法PCR出条带。待DNA测序分析正确后，我们成功构建了MG003突变株。

图4 MG001、MG002和MG003突变菌株构建验证Fig.4 Verification of MG001，MG002 and MG003 mutant strains by PCR

为了研究大片段puuE-ynaI的缺失对菌株的生长特性的影响，我们以MG1655为对照菌，将MG003在LB培养基中进行生长曲线的测定。如图5所示，在6 h前，MG003的生长一直优于野生型MG1655，但6 h后，生长变慢。在培养14 h后，MG003的OD600达到4.78，而野生型MG1655的OD600为5.03。两菌株的pH变化趋势并无明显区别，都是3 h之前下降，3 h之后逐步上升。结果表明，大片段puuE-ynaI的缺失会略微影响菌株的生长，而不会影响生长过程中的pH。对数期生长的加快且最终OD600的降低有利于发酵生产L-苏氨酸，因为对数期的加快可以缩短发酵周期，并且在不影响菌株活力的情况下，OD600的降低可以使更多的碳源合成我们所需要的目标产物。

图5 MG003的生长曲线测定Fig.5 Measurement of growth curve of MG003

2.2 大肠杆菌基因组中34个非必需基因的删除有利于L-苏氨酸合成

基因puuE到ynaI之间的DNA分子含有操纵子pspFABCDE和ycjMNOPQRSTUV，还包括ymjB、ycjG等单基因片段。为了研究大片段puuE-ynaI对L-苏氨酸发酵的影响，质粒pFW01-thrA*BC分别转入到野生型MG1655和突变株MG003中。摇瓶发酵结果见图6。MG003/pFW01-thrA*BC的生长明显优于对照菌MG1655/pFW01-thrA*BC，并且葡萄糖消耗速率有略微提高。可能是由于基因组的精简，导致更多的碳源用于生长。在发酵36 h后，L-苏氨酸在MG003/pFW01-thrA*BC中的产量达到0.64 g/L，相较于对照菌MG1655/pFW01-thrA*BC提高了25.5%。这些数据表明，大片段puuE-ynaI的缺失可以促进菌株的生长和提高L-苏氨酸的产量。为了探究胞内代谢水平变化，发酵36 h后，我们也对副产物乙酸和中间代谢物丙酮酸进行了测定。如图6（c）所示，与对照菌MG1655/pFW01-thrA*BC相比，MG003/pFW01-thrA*BC乙酸质量浓度下降7.5%，丙酮酸质量浓度上升9.3%。表明大片段puuE-ynaI的缺失降低了丙酮酸向乙酸的转化率。

图6 MG1655/pFW01-thrA*BC和MG003/pFW01-thrA*BC的摇瓶发酵Fig.6 Flask cultivation of MG1655/pFW01-thrA*BC and MG003/pFW01-thrA*BC strains

为了更好地解释发酵过程中OD600、葡萄糖消耗、L-苏氨酸和有机酸的质量浓度在MG1655/pFW01-thrA*BC和MG003/pFW01-thrA*BC的不同，对与L-苏氨酸代谢的相关基因ppc、pck、gltA、aspC、aceA和aceB的转录水平进行了测定。基因ppc的转录水平显著上调，而pck略微上调，表明从磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸路径被加强，而草酰乙酸是L-苏氨酸合成的前体物质，aspC基因的略微上调可以将草酰乙酸更多的转向L-天冬氨酸[22]，这正好解释L-苏氨酸的产量在MG003/pFW01-thrA*BC菌株中的增加。另一方面，基因gltA的转录水平上调可以促进更多的碳流从丙酮酸转向TCA循环，而不是合成副产物乙酸[23]。基因aceA和aceB的转录水平有略微下调，表明乙醛酸循环并没有由于大片段puuE-ynaI的缺失而激活。在大片段puuE-ynaI之间的DNA分子中，基因puuE和tyrR被分别报道与GABA和L-色氨酸合成相关[11-12]；基因ycjG、mpaA、ycjYZ和mppA都与肽聚糖的降解相关[13]。操纵子pspFABCDE与内膜修复相关[9]，操纵子ycjMNOPQRSTUV被认为作用于未知碳水化合物的分解代谢[10]，这些已知的功能与L-苏氨酸的合成并无直接联系。而ycjWXF、ymjB、tpx、ymiC和ynaI基因的功能尚未被完全揭开。在本研究中，我们证明了大片段puuE-ynaI的缺失并不会损害菌株的生长性能，反而能提高L-苏氨酸的合成能力。

2.3 通过加强L-苏氨酸的外转运进一步提高L-苏氨酸产量

为了进一步增加L-苏氨酸的产量，在MG003中分别转入pFW 01-thrA*BC-rhtA和pFW01-thrA*BC-rhtC，构建菌株MG003/pFW01-thrA*BCrhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC。以MG003/pFW01-thrA*BC为对照，将MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC进行摇瓶发酵。如图7所示，MG003/pFW01-thrA*BCrhtA的生长和糖耗与对照菌MG003/pFW01-thrA*BC无明显区别，而MG003/pFW01-thrA*BCrhtC在发酵前中期生长慢于MG003/pFW01-thrA*BC，葡萄糖消耗速率也随之降低。但是发酵36 h后，L-苏氨酸在MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC分别达到了0.73、0.89 g/L。较MG003/pFW01-thrA*BC分别提高了15.8%和36.5%。这些结果表明，rhtA和rhtC的加强都可以增加L-苏氨酸的产量，但rhtC增加的效果更明显，RhtA并不是特异性L-苏氨酸输出蛋白质，它还可以向胞外转运L-丝氨酸，而RhtC底物专一性更好，只能转运L-苏氨酸[24]。为了进一步探究加强rhtA和rhtC的表达对胞内代谢水平的影响，发酵36 h后，对副产物乙酸和中间代谢物丙酮酸进行了测定。与对照菌MG003/pFW01-thrA*BC相比，MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA乙酸质量浓度无明显变化，丙酮酸略微降低；而MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC中乙酸和丙酮酸质量浓度都显著降低，分别为8.49、0.34 g/L，下降了15.5%和67.6%。表明加强rhtC的表达更能促进碳流从丙酮酸转向TCA循环来积累L-苏氨酸，而不是合成副产物乙酸。

图7 MG003/pFW01-thrA*BC，MG003/pFW01-thrA*BCrhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC的摇瓶发酵Fig.7 Flask cultivation of MG003/pFW01-thrA*BC，MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA and MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC strains

3 结语

通过利用CRISPR-Cas9和系统Cre/loxP系统对大肠杆菌puuE-ynaI之间34个非必需基因进行敲除，构建了菌株MG003。通过高表达L-苏氨酸合成途径中关键基因thrA*、thrB和thrC以及L-苏氨酸转运酶编码基因rhtA和rhtC提高L-苏氨酸产量。与对照菌MG1655/pFW01-thrA*BC相比，MG003/pFW01-thrA*BC生长加快，L-苏氨酸产量提高25.5%；MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA的L-苏氨酸产量提高了43.3%；MG003/pFW01-thrA*BCrhtC的L-苏氨酸产量提高了74.5%。研究发现，大片段puuE-ynaI的缺失可以增强ppc和gltA基因的转录水平，基因ppc转录水平的提高可以增加L-苏氨酸的前体物质草酰乙酸的质量浓度，基因gltA的转录水平提高可以增加TCA循环通量，从而促进菌株的生长。基因aspC的转录水平也略微提高，这些正好可以解释在突变株MG003中L-苏氨酸的产量的增加。加强rhtA和rht C的表达都可以进一步增加L-苏氨酸的产量，但rhtC增加更为明显，并且乙酸和丙酮酸质量浓度都显著降低，更加有利于L-苏氨酸的积累。作者通过敲除34个非必需基因提高了L-苏氨酸的产量，此外在大肠杆菌基因组中还有很多非必需基因簇，通过大肠杆菌基因组精简，减少碳源的非必需消耗，也可以用来提高其他目标代谢产物的产量，并且对工业化菌株的改造具有指导意义。