Repsox 对人胚胎干细胞分化为肝细胞的影响

李秋鸿卢嘉怡

（广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东 广州510006）

原位肝移植能够显著提高终末期肝病患者的生存率和生活质量，但是这项技术非常昂贵和复杂，并且受到肝脏供体的限制［1］。 人原代肝细胞被认为是药理学与毒理学、细胞移植研究的合适模型［2］。动物实验研究结果表明，肝细胞移植可以用于治疗肝脏代谢性疾病以及肝功能衰竭［3］。 在某些特定的情况下，肝细胞移植还能够促进宿主的肝细胞再生，从而使宿主避免了后续的器官移植治疗。 然而人原代肝细胞的来源非常有限，在体外很难培养与扩增［4］。 人多能干细胞（包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞）能够在体外合适的分化体系下被定向诱导为肝细胞，这为肝脏疾病潜在药物的筛选、肝脏疾病模型的建立以及肝细胞移植治疗提供了可再生的细胞来源［5］。 肝细胞分化的过程一般包括将人多能干细胞定向诱导为原条、定型内胚层、前肠以及肝祖细胞，最后分化为肝细胞［6］。 由于细胞存在异质性以及往往经历比较长的诱导周期，人们总是很难将多能干细胞完全诱导分化为某种单一类型的细胞群体，因此体外肝细胞的诱导效率并不高［6］。因此，本研究旨在探索并建立一套能够显著提高肝分化效率的方法。 研究发现在肝细胞分化后期加入一种化学小分子药物-Repsox，可以比较显著地提高肝细胞的分化效率；经Repsox 处理后，细胞群体能够分泌更多的白蛋白（albumin），并合成更多的尿素（urea）。

1 材料

1.1 细胞

人类胚胎干细胞株H1 来自于威斯康星州WiCell 研究所（Wicell，Madison，WI）。

1.2 主要试剂

mTeSR1（Stemcell Technologies）；Matrigel（BD Biosciences）；Accutase（Sigma）；RPMI／B27（Gibco）；Activin A （Peprotech）； BMP2 （Peprotech）； FGF4（Peprotech）；HGF（Peprotech）；KGF（Peprotech）；Oncostatin-M （ R＆D Systems）； hepatocyte culture media（HCM，Lonza）；Repsox（Selleck）；Trizol 试剂（MRC）；ReverTra Ace qPCR RT Kit （TOYOBO）；SYBR Premix Ex Taq Kit（TAKARA）；TGFβ1 ELISA Kit（R＆D Systems）；Albumin ELISA Kit（KOMABIOTECH）；FBS （HyClone）；ALB 抗体（GeneTex）；Alexa Fluor®488 Donkey Anti-Goat IgG Antibody （Invitrogen）；DAPI（Sigma）。

1.3 主要仪器

倒置荧光显微镜（德国Carl Zeiss，型号：Zeiss Axiovert A1）； CFX96 Touch 实时荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad 公司，型号：CFX96 Touch）；Zeiss LSM 710 共聚焦显微镜（德国Carl Zeiss，型号：Carl Zeiss LSM710）； 全自动生化分析仪（迈瑞Mindray，型号：BS-450）。

2 方法

2.1 干细胞培养与肝细胞定向分化

人类胚胎干细胞培养：将未分化的人类胚胎干细胞H1 接种于铺有Matrigel 的培养板上，加入mTeSR1 培养液在37 ℃、5%（φ）CO2的条件下进行单层培养。 当细胞密度较大时，采用Accutase 消化液按照1 ∶4～1 ∶6的比例进行传代。

肝细胞定向分化［11］：当细胞密度接近95%左右时，加入含有100 ng／mL Activin A 重组蛋白的RPMI／B27 培养液诱导培养3 d（D3）；然后加入含有20 ng／mL BMP2 蛋白和30 ng／mL FGF4 蛋白的RPMI／B27 培养液诱导培养4 d（D7）；随后加入20 ng／mL HGF 蛋白和20 ng／mL KGF 蛋白的RPMI／B27 培养液诱导培养6 d（D13）；最后在含有20 ng／mL Oncostatin-M 的肝细胞培养液（不含有EGF）诱导培养8 d（D21）。 实验组在D13 开始添加1 μm Repsox 直至D21 结束。

2.2 RT-qPCR 检测TGFβ1 的表达

在肝细胞定向诱导过程中，用Accutase 消化液处理D0、D3、D13、D21 的细胞，收集细胞悬液后离心，加入约1 mL Trizol 试剂，使细胞完全裂解。 加入氯仿，取水相至预冷的异丙醇中获得RNA 沉淀，将其重新溶解于蒸馏水中测定浓度。 依据ReverTra Ace qPCR RT Kit 的说明书，将2 μg RNA 反转为cDNA 并适度稀释，用作下一步qPCR 反应的模板。采用SYBR Premix Ex Taq Kit 进行qPCR 反应，以GAPDH为内参。

所用引物的序列如下：TGFβ1，5′-CTAATGGTG GAAACCCACAACG-3′（正向），5′-TATCGCCAGGAA TTGTTGCTG-3′（反 向）；GAPDH，5′-AGGGCTGCT TTTAACTCTGGT-3′（正向），5′-CCCCACTTGATTTTG GAGGGA-3′ （反向）。

2.3 酶联免疫吸附（ELISA）检测TGFβ1 蛋白、albumin 蛋白的含量

严格按照TGFβ1 ELISA Kit、Albumin ELISA Kit说明书的操作步骤进行。

2.4 尿素含量测定

当细胞分化至21 d，在培养液中额外加入5 mmol／L NH4Cl，将细胞继续在5%CO2，37 °C 培养24 h。 收集培养液上清，离心取上清。 依据紫外-谷氨酸脱氢酶法，利用全自动生化分析仪测定培养液上清中的尿素含量。

2.5 免疫荧光检测albumin 蛋白的表达

采用4%（φ）多聚甲醛固定细胞30 min，加入0.3% Triton X-100 溶液通透30 min，然后加入10%FBS 溶液室温孵育1 h。 加入羊抗人ALB 一抗于4 ℃冰箱中孵育12 h，PBS 清洗3 次，再加入Alexa Fluor® 488 标记的驴抗羊二抗避光孵育1 h，最后加入DAPI 避光孵育5 min，PBS 清洗3 次后封片。 使用Zeiss LSM 710 共聚焦显微镜进行拍照。

2.6 统计学方法

采用IBM SPSS Statistics（1.0.0.1275）统计软件对结果进行统计学分析，实验数据以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 肝细胞分化过程中TGFβ1 的mRNA 表达量和蛋白分泌量变化

人胚胎干细胞株H1 定向诱导为肝细胞过程中，细胞的形态发生了显著的变化，由典型的上皮样细胞（D0）变化为间充质样细胞（D3）再转变为上皮样的肝细胞（D21），见图1。 肝细胞分化过程中TGFβ1 的mRNA 表达量和蛋白分泌量都呈现先大幅增加后缓慢减少的趋势，与D21 细胞相比，胚胎干细胞中TGFβ1 的mRNA 表达和蛋白分泌水平较低（P＜0.01）；而D3 和D13 细胞群体的TGFβ1的mRNA 表达和蛋白分泌水平较高（P＜0.05），见图2。

3.2 Repsox 对肝细胞中TGFβ1 的mRNA 表达和蛋白分泌水平的影响

在体外肝细胞诱导分化的第4 阶段，加入TGFβ信号通路的特异性抑制剂Repsox，通过检测D21 细胞中TGFβ1 的mRNA 表达量以及上清培养液中TGFβ1 蛋白分泌量发现，加入Repsox 能够显著地抑制D21 细胞中TGFβ1 的mRNA 表达量（P＜0.05）和上清培养液中TGFβ1 蛋白的分泌量（P＜0.05），结果见图3。

图1 肝细胞分化过程中细胞的形态变化（标尺：20 μm，100×）Figure 1 Morphological changes of hepatocytes during differentiation of hESCs （Scale bar： 20 μm，100×）

图2 肝细胞分化过程中TGFβ1 的mRNA 表达量和蛋白分泌量变化Figure 2 Changes of TGFβ1 mRNA expression and protein secretion during hepatocyte differentiation

3.3 Repsox 对肝细胞体外诱导分化效率的影响

如图4 所示，实验组中表达ALB 蛋白的细胞数量多于对照组。 与此同时，实验组中albumin 分泌量以及尿素合成量明显高于对照组（P＜0.05），结果见图5。

图3 Repsox 抑制肝细胞中TGFβ1 的mRNA 表达量和蛋白分泌量Figure 3 Inhibition of Repsox on TGFβ1 mRNA expression and protein secretion in hESCs-derived hepatocytes

图4 对照组与实验组D21 细胞中ALB 蛋白的表达情况（标尺：20 μm）Figure 4 ALB expression in D21 cells treated with or without Repsox （Scale bar： 20 μm）

图5 对照组与实验组D21 细胞中白蛋白分泌量及尿素合成量测定Figure 5 Determination of albumin secretion and urea synthesis in D21 cells treated with or without Repsox

4 讨论

人多能干细胞在体外具有自我更新和多谱系分化的潜能，它们在诸多方面都与胚胎外植体有相似之处，因此它们是人们研究胚胎发育的重要体外模型［7］。 人多能干细胞能够在多重信号分子的连续作用下转变为肝细胞，该过程的进行涉及多种信号通路的参与，相关分子机制尚不完全清楚［8］。 在人肝细胞体外分化过程中，细胞会在分化初期由原本的上皮细胞状态转变为间充质细胞状态；到分化后期，细胞又会由间充质细胞状态逐渐回到上皮细胞状态，即发生了上皮-间充质转化和间充质-上皮转化两个事件［9］。 前一个事件的发生比较明显，容易观察与检测；而后一个事件的发生却不太显著，对诱导至第21 天的细胞进行RT-qPCR 检测，还能够发现某些特定间充质标志物的表达［9］。 这可能是体外诱导的肝细胞在成熟度和功能方面不及原代肝细胞的原因之一［10］。

上皮-间充质转化及其逆过程的发生往往与TGFβ 通路密切相关［11-12］，本研究检测了肝细胞诱导分化过程中TGFβ1 蛋白的表达情况，结果发现：TGFβ1 基因的表达和蛋白分泌量在诱导分化初期显著上调，而在诱导分化末期则逐渐下调，但下调幅度远不及上调幅度大，由此推测TGFβ1 基因的不完全下调可能是影响肝细胞分化效率的因素之一。 本研究试图通过在肝细胞诱导分化后期添加小分子抑制剂Repsox 来抑制TGFβ1 基因的表达［13］，并评估其对肝细胞分化效率及肝细胞功能的影响。 实验结果表明，在分化后期加入Repsox 以后，诱导至第21 天的细胞群体中表达白蛋白的细胞数量增加；检测诱导至第21 天的细胞群体的白蛋白分泌量和尿素合成量，均发现相比于对照组有了显著的增加。 以上结果说明，通过在诱导分化后期加入小分子抑制剂Repsox 有利于促进TGFβ1 基因的表达下调，最终引起肝细胞的分化效率以及肝细胞功能水平的增加。

本研究建立了提高体外肝分化效率及改善肝细胞功能的方法，为下一步建立病人个性化的体外疾病模型和药筛模型提供了参考；功能上更接近于原代成熟肝细胞的诱导肝细胞的获得，为肝细胞移植治疗提供了可靠的再生资源。