补肝益肾颗粒质量标准研究

张靖年毕晓黎胥爱丽李养学李素梅蓝森梅

（1.广东省中医药工程技术研究院／广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州510095；2.中山大学新华学院，广东 广州510520）

补肝益肾颗粒原方系广东省第二中医院骨科专家常用的临床验方，由淫羊藿、山药、续断、白芍、泽泻、制何首乌等8 味中药组成，方中淫羊藿补肝肾之阳［1］，为君药。 温性之杜仲［2］、续断［3］、桑寄生［4］为臣药，能补肝肾、强筋骨。 佐以制何首乌补益精血［5］，泽泻利湿而泄肾浊［6］，白芍柔肝敛阴［7］。 全方肝肾同补，补中寓泄，共奏补益肝肾作用。 该方临床疗效良好，但汤剂存在煎煮、携带、使用不方便的特点。 现将其制成颗粒剂，既保持原汤剂的特色和优势，又具有体积小、利于储藏、便于携带、使用方便等优点。 但该制剂目前尚无质量标准，为较好地控制其质量以保证临床疗效，本试验采用TLC 法定性鉴别方中君药淫羊藿、佐药白芍、制何首乌等药味。研究表明，淫羊藿苷具有改善骨代谢、治疗骨质疏松症等药理作用［8-9］，还可改善生殖功能［10-11］、保护肾脏［12］；川续断皂苷Ⅵ对成骨分化具有促进作用［13-14］，并具有一定的肝脏保护作用［15-16］，这与补肝益肾颗粒的功效有一定的关联性。 因此，本试验采用HPLC 法定量测定君药淫羊藿所含淫羊藿苷、臣药续断所含川续断皂苷Ⅵ的质量分数，以期为本品质量控制提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

CAMAG TLC SAMPLER 4 型自动点样仪，CAMAG REPROSTAR 3 型薄层成像系统（瑞士CAMAG 公司）；Waters e2695 Sepatation Module 高效液相色谱仪，Waters 2998 PDA 检测器，四元梯度泵，Empower Pro 色谱工作站（美国Waters 公司）；KQ5200DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER XS205DU 型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；HH-8 数显恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）；MilliPore Advantage A10 自动纯水机（美国MilliPore 公司）。

1.2 试药

乙腈等HPLC 所用试剂均为色谱纯（德国默克公司）；水为屈臣氏蒸馏水；其他试剂均为分析纯（广州化学试剂厂）。

补肝益肾颗粒（批号：20181004、20181005、20181006）由广东省第二中医院制剂室提供；淫羊藿对照药材（批号：121632-201502）、白芍对照药材（批号：120905-201610）、制何首乌对照药材（批号：121454-201405）、淫羊藿苷对照品（批号：110737-201516，质量分数94.2%）购自中国食品药品检定研究院；川续断皂苷Ⅵ对照品（批号：C-014-170717，质量分数98.3%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 淫羊藿的鉴别取本品2 g，加水20 mL 使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2 次，每次20 mL，混合乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。 另取淫羊藿对照药材0.4 g，加水适量，加热至沸腾并保持微沸30 min，滤过，滤液浓缩至约20 mL，自“用乙酸乙酯振摇提取2 次”起，同法制成对照药材溶液。 再取除淫羊藿外处方比例的其余7味中药，按处方工艺制备阴性样品，取阴性样品2 g，自“加水20 mL 使溶解”起，同法制成淫羊藿阴性对照溶液。 按照薄层色谱法［17］试验，吸取上述溶液各3 μL，分别点于同一硅胶H 薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（体积比13 ∶10 ∶10）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以AlCl3试液，105 ℃加热2 min，置紫外光灯（365 nm）下检视。 供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。 见图1。

图1 淫羊藿鉴别的薄层色谱图Figure 1 TLC of Epimedii Folium

2.1.2 白芍的鉴别取本品4 g，研细，加乙醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和正丁醇溶液萃取2 次，每次20 mL，混合水饱和正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。 另取白芍对照药材1 g，加水适量，加热至沸腾并保持微沸30 min，滤过，滤液浓缩至约20 mL，自“用水饱和正丁醇溶液萃取2 次”起，同法制成对照药材溶液。 再取除白芍外处方比例的其余7 味中药，按处方工艺制备阴性样品，取阴性样品4 g，自“加乙醇25 mL”起，同法制成白芍阴性对照溶液。 按照薄层色谱法［17］试验，吸取供试品、对照药材及阴性对照3 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（体积比40 ∶5 ∶10 ∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以5%（质量浓度）香草醛硫酸溶液，105 ℃加热约1 min。 供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点，阴性对照无干扰。 见图2。

图2 白芍鉴别的薄层色谱图Figure 2 TLC of Paeoniae Radix Alba

2.1.3 制何首乌的鉴别取本品4 g，加水30 mL 使溶解，用乙醚振摇提取2 次，每次30 mL，混合乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。 另取制何首乌对照药材1 g，加适量水煮沸30 min，滤过，滤液浓缩至约30 mL，自“用乙醚振摇提取2 次”起，同法制成对照药材溶液。 再取除制何首乌外处方比例的其余7 味中药，按处方工艺制备阴性样品，取阴性样品4 g，自“加水30 mL 使溶解”起，同法制成制何首乌阴性对照溶液。 按照薄层色谱法［17］试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（体积比10 ∶1 ∶1 ∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。 供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。 见图3。

2.2 定量测定

2.2.1 对照品溶液的制备取淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 分别含淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ254.75、113.75 μg 的混合对照品溶液，即得。

图3 制何首乌鉴别的薄层色谱图Figure 3 TLC of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

2.2.2 供试品溶液的制备取本品适量，研细，精密称取1 g，加甲醇25 mL，称定质量，水浴加热回流处理60 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 空白溶液的制备取甲醇溶液适量，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 色谱条件与系统适用性研究色谱柱：phenomenex Luna Omega Polar C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流动相：乙腈（A）-水（B）：0 ～20 min，25%A→30%A；20 ～30 min，30%A；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL／min；检测波长：212 nm；进样量：10 μL。分别精密吸取对照品、供试品、空白溶液10 μL，按上述条件测定，理论塔板数按淫羊藿苷计，不低于3 000；分离度＞1.5。 见图4。

2.2.5 线性关系考察分别精密称取淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ10.19、4.55 mg，置于同一10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，记编号MS1。 精密吸取MS1 5 mL 置于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，记编号MS2；依次倍比稀释制得MS3～MS6。 分别精密吸取上述6 种混合对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.2.4”项下色谱条件测定。 以对照品进样量X为横坐标，对应的峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ的回归方程分别为Y1＝1．998 5×105X1-7．369 4×104（r1＝0．999 9）、Y2＝1．791 5×105X2-5．836 2×103（r2＝0．999 9），线性范围分别为：进样量0.318 4 ～10.190 0 μg、0.142 2 ～4.550 0 μg。 表明淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ进样量与峰面积之间均具有良好的线性关系。

图4 淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ的HPLC 色谱图Figure 4 HPLC chromatograms of icariin and asperosaponin Ⅵ

2.2.6 精密度试验取批号为201801005 的补肝益肾颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.4”项下方法测定，连续进样测定6 次，计算淫羊藿苷和川续断皂苷Ⅵ峰面积RSD 值分别为0.38%和0.46%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验取批号为201801005 的补肝益肾颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.4”项下方法，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样测定。 计算得淫羊藿苷和川续断皂苷Ⅵ峰面积RSD值分别为0.88%和0.97%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验取批号为201801005 的补肝益肾颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.4”项下方法测定，平行操作6 份。 计算得淫羊藿苷和川续断皂苷Ⅵ的平均质量分数分别为0.148 8%、0.193 6%，RSD 值分别为1.60%和1.72%，表明本方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验取已知淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ质量分数分别为0.149 4%、0.193 0%的补肝益肾颗粒（批号：201801005）9 份，每份0.5 g，精密称定。 分别加入为样品中待测成分约0.5、1.0、1.5倍量的淫羊藿苷和川续断皂苷Ⅵ，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.4”项下色谱条件分别进样测定，计算回收率。 结果淫羊藿苷和川续断皂苷Ⅵ平均回收率分别为99.82%、100.70%，表明回收率良好。 见表1。

表1 补肝益肾颗粒中淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ加样回收率试验结果Table 1 Recovery results of icariin and asperosaponin Ⅵin Bugan Yishen granules （n＝9）

2.2.10 样品质量分数测定分别取批号20181004、20181005、20181006 的补肝益肾颗粒各2 份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，计算淫羊藿苷和川续断皂苷Ⅵ的质量分数，结果见表2。

表2 补肝益肾颗粒中淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ质量分数测定结果Table 2 The contents of icariin and asperosaponin Ⅵin Bugan Yishen granules （n＝2） w／%

结果显示，3 批补肝益肾颗粒中淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ的平均质量分数分别为0.154 3%和0.194 5%，以平均质量分数的80%设限，规定本品淫羊藿苷质量分数不得低于0.124%，川续断皂苷Ⅵ质量分数不得低于0.156%。

3 讨论

补肝益肾颗粒为水提制剂，因此进行质量分数测定样品前处理时考察了甲醇-水和乙醇-水溶媒体系，分别在甲醇、50%（体积分数，下同）甲醇、乙醇和50%乙醇4 种溶媒条件下测定淫羊藿苷和川续断皂苷Ⅵ的质量分数，结果表明甲醇提取效果最佳。淫羊藿苷最大吸收波长为270 nm，而川续断皂苷Ⅵ为212 nm，经试验发现，在212 nm 下测定淫羊藿苷质量分数与270 nm 下检测时相比，结果区别不大，因此选取212 nm 作为测定波长同时测定2 种化学成分的质量分数。

本试验建立的质量标准可快速、准确反映该制剂质量，为其临床疗效及质量控制提供了理论依据，对补肝益肾颗粒的进一步开发具有一定的指导意义。