炒薏苡仁油对乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 细胞凋亡的影响及其相关氧化应激机制
2020-03-20郑显辉龚又明邓广海覃军黄昌杰罗明超谢鸣坤高巍
郑显辉龚又明邓广海覃军黄昌杰罗明超谢鸣坤高巍
(1.广州中医药大学第二附属医院药学部,广东 广州510120; 2.广东省中医药学会中药专业委员会,广东 广州510120; 3.广州今典精方药业有限公司,广东 广州510000; 4.广州中医药大学中药学院,广东 广州510006)
乳腺癌作为严重威胁世界女性健康的杀手之一,占女性所患恶性肿瘤的13.7%,且发病率逐年攀升[1]。 虽然现代医学对乳腺癌的诊治工作取得了显著进展,但耐药现象的出现,伴随着乳腺癌复发、转移则成为最大的医学难题[2]。 目前乳腺癌的治疗包括手术治疗、内分泌治疗、放、化疗以及分子靶向治疗[3],临床效果欠佳。 化疗对人体有较大的损伤,因此现代科学将目光投向中药、植物等天然产物及其提取物。 DNA 损伤是癌变过程中的关键步骤,而氧化应激是DNA 损伤的重要原因。 有研究表明,活性氧(ROS)能够通过多种机制影响癌症的发生发展[4]。 薏苡仁为禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var. ma-yuen(Roman) Stapf 的干燥成熟种仁[5],始载于《神农本草经》,列为上品。 薏苡仁油是薏苡仁提取物,现代研究表明,它有利于肿瘤的治疗,能够降低癌症患者的疼痛水平,显著提高患者的生活质量,且没有明显的不良反应[6]。 炒薏苡仁是薏苡仁常见炮制品,有研究发现,薏苡仁经过炒制后,抗肿瘤成分甘油三油酸酯的含量明显增加[7-9],脂肪油及亚油酸含量也发生变化[10]。 目前,关于炒薏苡仁及其提取物抗肿瘤作用研究未见报道,本研究采用炒薏苡仁油处理人乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 细胞,观察其对该细胞凋亡的影响,并通过对ROS 和相关基因表达的检测来探讨其可能的机制,为临床中乳腺癌的治疗提供新的研究思路。
1 材料与方法
1.1 材料
MCF-7 和ZR-75-1 细胞购买于中科院细胞库;RPMI1640 及胎牛血清购买于美国Gibico 公司;二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)试剂均购买于美国Ameresco 公司;ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购买于南京建成生物工程研究所;Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDKDA Eraser、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 等试剂盒均购买于TaKaRa 公司;PCR 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供;Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购买于江苏凯基生物技术股份有限公司;Bax、Bcl-2 抗体购买于Cell Signaling Technology 公司。
炒薏苡仁(批号181109041)购于康美药业股份有限公司,经广东省中医院主任中药师覃军鉴定为禾本科植物薏苡的成熟种仁炒制品,炒薏苡仁油由本实验室自行制备,提取物配成质量浓度为1 g/mL母液,用RPMI1640 完全培养基稀释成需要的浓度直接作用于细胞,用0.22 μm 的微孔过滤膜过滤,备用。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养将人乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1细胞置于含10%(φ)胎牛血清的RPMI1640 培养基中培养,放入37 ℃、5%(φ)CO2培养箱中培养3 ~4 d,待细胞生长至密度为80%~90%时,以0.25%的胰蛋白酶进行消化及传代处理。
1.2.2 MTT 法检测细胞活性分别取对数生长期的人乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 细胞,约1×104/孔接种于96 孔板,过夜贴壁后,对照组加入完全培养基,实验组分别加入含不同浓度的炒薏苡仁油的培养基,每组设置6 个复孔。 炒薏苡仁油的终质量浓度为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg/mL 培养36 h及48 h 后,加入20 μL 5 mg/mL 的MTT 继续培养4 h,吸弃培养液,每孔加入150 μL 的DMSO,在酶联免疫检测仪490 nm 处测量各孔的吸光度(A)。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡分别取对数生长期的人乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 细胞,约10×104/孔接种于6 孔板,过夜贴壁后,对照组加入完全培养基,实验组分别加入含不同浓度的炒薏苡仁油的培养基,炒薏苡仁油的终质量浓度为0、0.125、0.250、0.500 mg/mL 培养48 h 后,消化细胞,1 000 r/min 离心5 min,收集细胞,重悬后加入5 μL Annexin V 和PI 试剂避光条件染色15 min,在1 h内上机检测。
1.2.4 RT-PCR 检测CDK4、CyclinA、CyclinE、Bax、Bcl-2 的表达水平实验分为对照组、3 个不同质量浓度炒薏苡仁油(0.125、0.250、0.500 mg/mL)处理组。 分别将对数生长期的MCF-7 和ZR-75-1 细胞按照每4×105/孔接种到6 孔板中,药物处理48 h 后用Trizol 裂解细胞提取细胞总RNA,利用逆转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA 再使用荧光定量试剂盒加入相应的引物进行扩增,上机检测。 内参为GAPDH,目的基因为CDK4、CyclinA、CyclinE、Bax、Bcl-2,引物序列见表1。
表1 引物序列和产物长度Table 1 Primer sequence and product length
1.2.5 Western blot 检测细胞凋亡蛋白的表达分别取对数生长期的人乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 细胞,约10×104/孔接种于6 孔板,过夜贴壁后,对照组加入完全培养基,实验组分别加入含不同浓度的炒薏苡仁油的培养基,炒薏苡仁油的终质量浓度为0、0.125、0.250、0.500 mg/mL 培养48 h 后,加入裂解液裂解细胞,刮下6 孔板细胞在冰上裂解30 min,14 000 r/min离心10 min,取上清,煮沸5 min 获得变性蛋白。 蛋白经过SDS-PAGE 胶分离后转移至PVDF 膜上,5%BSA 封闭1.5 h,TBST 洗涤3 次,每次5 min,孵育一抗,4 ℃过夜。 过夜孵育后洗涤3次,孵育二抗1 h,洗涤,利用ECL 发光液曝光,获得条带。
1.2.6 酶联免疫吸附法检测ROS 及其相关氧化应激水平按照“1.2.3”项下方法进行细胞种板和给药处理,吸取细胞上清液,采用ELISA 试剂盒说明书进行处理,在酶联免疫检测仪450 nm 处测量各孔的吸光度。 以ROS、SOD、GPX、CAT 的含量为纵坐标,450 nm 处的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,根据标准曲线计算各组样品中的ROS、SOD、GPX、CAT 含量。
1.2.7 统计学处理应用SPSS 20.0 软件统计分析,计量数据以(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 炒薏苡仁油对细胞活性以及细胞凋亡的影响
将MCF-7 和ZR-75-1 细胞分别采用不同浓度炒薏苡仁油处理36 h 和48 h 后,采用MTT 法检测细胞的存活率变化,结果见表2、表3。 与对照品比较,质量浓度为0.500 mg/mL、1.000 mg/mL 和2.000 mg/mL 炒薏苡仁油处理36 h 后,MCF-7 和ZR-75-1细胞的A 值差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01);处理48 h 后,不同浓度炒薏苡仁油组中MCF-7 和ZR-75-1 细胞的A 值差异均有统计学意义(P<0.05 或P<0.01),且其测定值具有时间和浓度依赖性。 根据检测结果,选用浓度为0.125、0.250 及0.500 mg/mL 炒薏苡仁油干预细胞48 h 进行后续研究。
表2 不同浓度炒薏苡仁油处理后MCF-7 细胞的A 值Table 2 A value of MCF-7 cells treated with fried coix seed oil of different concentrations(±s)
表2 不同浓度炒薏苡仁油处理后MCF-7 细胞的A 值Table 2 A value of MCF-7 cells treated with fried coix seed oil of different concentrations(±s)
与对照组比较:∗P<0.05,∗∗P<0.01。
组别 ρ/(mg·mL-1) 36 h 48 h对照组 - 0.503±0.003 0.514±0.003 0.125 0.451±0.002 0.402±0.001∗0.250 0.423±0.001 0.378±0.002∗炒薏苡仁油 0.500 0.375±0.003∗ 0.322±0.003∗∗1.000 0.328±0.003∗∗0.298±0.005∗∗2.000 0.271±0.005∗∗0.252±0.004∗∗
由MTT 结果可知炒薏苡仁油作用于细胞48 h后能够不同程度地抑制细胞生长。 接着利用流式细胞仪检测MCF-7 和ZR-75-1 细胞的凋亡情况,见图1、图2。 不同剂量(0、0.125、0.250、0.500 mg/mL)炒薏苡仁油处理MCF-7 细胞的凋亡率分别为(0.20±0.001)%、(1.16±0.01)%、(2.91±0.13)%、(5.43±0.02)%,处理ZR-75-1 细胞的凋亡率分别为(0.68±0.01)%、(5.21±0.07)%、(6.50±0.01)%、(12.80%±0.08)%,各药物处理组与对照组相比,随着给药浓度的提高其凋亡率呈现上升趋势。
表3 不同浓度炒薏苡仁油处理后ZR-75-1 细胞的A 值Table 1 A value of ZR-75-1 cells treated with fried coix seed oil of different concentrations(±s)
表3 不同浓度炒薏苡仁油处理后ZR-75-1 细胞的A 值Table 1 A value of ZR-75-1 cells treated with fried coix seed oil of different concentrations(±s)
与对照组比较:∗P<0.05,∗∗P<0.01。
组别 ρ/(mg·mL-1) A490(36 h) A490(48 h)对照组 - 0.511±0.004 0.525±0.003 0.125 0.489±0.004 0.410±0.005∗0.250 0.437±0.002 0.384±0.003∗炒薏苡仁油 0.500 0.382±0.002∗ 0.316±0.002∗1.000 0.321±0.001∗∗ 0.286±0.005∗2.000 0.265±0.001∗∗ 0.240±0.001∗∗∗∗
2.2 炒薏苡仁油对MCF-7 和ZR-75-1 细胞增殖相关基因表达的影响
结果见表4,表5。 与对照组比较,各组炒薏苡仁油均能显著下调MCF-7 和ZR-75-1 细胞中的CDK4、CyclinA 和CyclinE 的mRNA 表达(P<0.01 或P<0.05),且其表达水平具有浓度依赖性。
图1 炒薏苡仁油对MCF-7 细胞的影响Figure 1 Effect of fried coix seed oil on MCF-7 cells
图2 炒薏苡仁油对ZR-75-1 细胞的影响Figure 2 Effect of fried coix seed oil on ZR-75-1 cells
表4 不同浓度炒薏苡仁油对MCF-7 细胞中CDK4、CyclinA 和CyclinE 基因表达的影响Table 4 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of CDK4,Cyclin A and Cyclin E genes in MCF-7 cells(±s)
表4 不同浓度炒薏苡仁油对MCF-7 细胞中CDK4、CyclinA 和CyclinE 基因表达的影响Table 4 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of CDK4,Cyclin A and Cyclin E genes in MCF-7 cells(±s)
与对照组比较:∗P<0.05,∗∗P<0.01。
组别 ρ/(mg·mL-1) CDK4 mRNA CyclinA mRNA CyclinE mRNA对照组 - 1.031±0.269 1.015±0.174 1.075±0.404炒薏苡仁油 0.125 0.647±0.000∗ 0.739±0.032∗ 0.504±0.013∗0.250 0.605±0.016∗ 0.650±0.129∗ 0.454±0.172∗0.500 0.543±0.049∗ 0.543±0.014∗∗ 0.392±0.127∗
表5 不同浓度炒薏苡仁油对ZR-75-1 细胞CDK4、CyclinA 和CyclinE 基因表达的影响Table 5 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of CDK4,Cyclin A and Cyclin E genes in ZR-75-1 cells
2.3 炒薏苡仁油对MCF-7 和ZR-75-1 细胞凋亡相关基因表达的影响
结果见表6、表7、图3、图4。 与对照组比较,各组炒薏苡仁油均能显著上调MCF-7 和ZR-75-1 细胞中的Bax的mRNA 和蛋白的表达(P<0.01 或P<0.05),下调Bcl-2 的mRNA 和蛋白的表达(P<0.01或P<0.05),且其表达水平具有浓度依赖性。
表6 不同浓度炒薏苡仁油对MCF-7 细胞Bax 和Bcl-2 表达的影响Table 6 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of Bax and Bcl-2 in MCF-7 cells(±s)
表6 不同浓度炒薏苡仁油对MCF-7 细胞Bax 和Bcl-2 表达的影响Table 6 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of Bax and Bcl-2 in MCF-7 cells(±s)
与对照组比较:∗P<0.05,∗∗P<0.01。
组别 ρ/(mg·mL-1) Bcl-2 mRNA Bax mRNA对照组 - 1.000±0.003 1.031±0.277炒薏苡仁油 0.125 0.617±0.228∗ 1.549±0.226∗0.250 0.553±0.016∗∗ 1.611±0.216∗0.500 0.483±0.096∗∗ 1.784±0.264∗
图3 不同浓度炒薏苡仁油对MCF-7 细胞Bax 和Bcl-2 表达的影响Figure 3 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of Bax and Bcl-2 in MCF-7 cells
表7 不同浓度炒薏苡仁油对ZR-75-1 细胞Bax 和Bcl-2 表达的影响Table 7 The effects of the expression of Bax and Bcl-2 in ZR-75-1 cells by Fried coicis seed oil at different concentrations(±s)
表7 不同浓度炒薏苡仁油对ZR-75-1 细胞Bax 和Bcl-2 表达的影响Table 7 The effects of the expression of Bax and Bcl-2 in ZR-75-1 cells by Fried coicis seed oil at different concentrations(±s)
与对照组比较:∗P<0.05,∗∗P<0.01。
组别 ρ/(mg·mL-1) Bcl-2 mRNA Bax mRNA对照组 - 1.000±0.003 1.031±0.277炒薏苡仁油 0.125 0.617±0.228∗ 1.549±0.226∗0.250 0.553±0.016∗∗ 1.611±0.216∗0.500 0.483±0.096∗∗ 1.784±0.264∗
图4 不同浓度炒薏苡仁油对ZR-75-1 细胞Bax 和Bcl-2 表达的影响Figure 4 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of Bax and Bcl-2 in ZR-75-1 cells
2.4 炒薏苡仁油对MCF-7 和ZR-75-1 细胞ROS 表达的影响
结果见表8。 与对照组比较,不同浓度的炒薏苡仁油能够提高MCF-7 和ZR-75-1 细胞中的ROS浓度,差异具有统计学意义(P<0.05 或P<0.01),且其测定值具有浓度依赖性。
2.5 炒薏苡仁油对MCF-7 细胞相关氧化应激指标的影响
结果见表9、表10。 与对照组比较,不同浓度的炒薏苡仁油能够提高MCF-7 和ZR-75-1 细胞中的SOD、GPX 和CAT 浓度,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),且其测定值具有浓度依赖性。
表8 不同浓度炒薏苡仁油对MCF-7 和ZR-75-1 细胞ROS表达的影响Table 8 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of ROS in MCF-7 and ZR-75-1 cells(±s)
表8 不同浓度炒薏苡仁油对MCF-7 和ZR-75-1 细胞ROS表达的影响Table 8 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of ROS in MCF-7 and ZR-75-1 cells(±s)
与对照组比较:∗P<0.05,∗∗P<0.01。
组别 ρ/(mg·mL-1) MCF-7 ZR-75-1对照组 - 7 427±117 5 862±67炒薏苡仁油 0.125 8 927±40∗ 6 927±40∗0.250 9 760±51∗ 8 907±79∗∗0.500 1 154±67∗∗ 9 882±68∗∗
表9 不同浓度炒薏苡仁油对MCF-7 细胞SOD、GPX、CAT 表达的影响Table 9 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of SOD,GPX and CAT in MCF-7 cells(±s)
表9 不同浓度炒薏苡仁油对MCF-7 细胞SOD、GPX、CAT 表达的影响Table 9 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of SOD,GPX and CAT in MCF-7 cells(±s)
与对照组比较:∗P<0.05,∗∗P<0.01。
组别 ρ/(mg·mL-1) SOD/(U·mL-1) GPX/U CAT/(U·mL-1)对照组 - 2.71±0.12 110.91±1.63 6.18±0.07炒薏苡仁油 0.125 3.40±0.14∗ 140.45±1.72∗ 7.26±0.09∗0.250 3.76±0.19∗ 147.51±0.56∗ 7.80±0.36∗0.500 4.17±0.12∗∗ 155.02±1.82∗ 8.21±0.07∗
表10 不同浓度炒薏苡仁油对ZR-75-1 细胞SOD、GPX、CAT 表达的影响Table 10 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of SOD,GPX and CAT in ZR-75-1 cells(±s)
表10 不同浓度炒薏苡仁油对ZR-75-1 细胞SOD、GPX、CAT 表达的影响Table 10 Effects of different concentrations of fried coix seed oil on the expression of SOD,GPX and CAT in ZR-75-1 cells(±s)
与对照组比较:∗P<0.05,∗∗P<0.01。
组别 ρ/(mg·mL-1) SOD/(U·mL-1) GPX/U CAT/(U·mL-1)对照组 - 1.82±0.02 105.20±4.77 4.22±0.09炒薏苡仁油 0.125 2.27±0.10 138.63±1.19∗ 5.43±0.08∗0.250 2.62±0.09∗ 145.28±2.09∗ 5.64±0.06∗0.500 2.73±0.04∗∗ 150.62±1.11∗ 5.94±0.02∗
3 讨论
薏苡仁油是从薏苡仁中提取而得,主要由油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸等长碳链脂肪酸组成,不饱和脂肪酸含量较高,所含1,2-亚油酸-3-油酸三酰甘油、1,2-油酸-3-亚油酸三酰甘油、1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸三酰甘油、甘油三油酸酯和1,2-油酸-3-棕榈酸三酰甘油等5 种三酰甘油含量较高[11-12]。 研究表明,薏苡仁中甘油三油酸酯[13]、亚油酸及其异构化的共辄亚油酸[14]具有均抗肿瘤作用。 本文研究发现,炒薏苡仁油能够抑制乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 细胞增殖,诱导其细胞凋亡,且其作用强度具有浓度依赖性。
有研究表明,薏苡仁油能够抑制癌细胞周期干预细胞的增殖过程,从而导致细胞凋亡[15]。 CDK 参与细胞的增殖,能够与Cyclin连接,CDK4 在细胞的G1 期被激活表达[16-17]。CDK4、CyclinA 和CyclinE过表达可引起细胞异常增殖和分化失去控制,引起肿瘤的发生。 本研究发现,经炒薏苡仁油干预后,细胞内CDK4、CyclinA 和CyclinE 基因表达量均明显下调,提示炒薏苡仁油可通过调控周期相关基因CDK4、CyclinA 和CyclinE 的表达来抑制MCF-7 和ZR-75-1 细胞周期;Bcl-2 家族在调节线粒体介导的凋亡通路中发挥着重要的作用,目前已在该家族中鉴定出20 多个成员,包括Bax 等促凋亡蛋白和Bcl-2 等抗凋亡蛋白[18],而Bcl-2/Bax可调控细胞凋亡并在乳腺癌治疗中发挥重要作用[19]。 本研究发现,经炒薏苡仁油干预后,MCF-7 和ZR-75-1 细胞中Bcl-2 的mRNA 水平明显降低,Bax的mRNA 水平明显增高,提示炒薏苡仁油可通过下调Bcl-2,上调Bax基因的表达,诱导细胞凋亡。
ROS 参与了癌细胞中DNA 损伤的关键步骤,影响着癌症的发生发展。 氧化应激及相关ROS 可修饰脂质、蛋白质、碳水化合物和核酸,诱导线粒体通透性的改变,从而诱导细胞凋亡[20]。 研究表明,乳腺癌组织ROS 含量较癌旁组织明显升高,处于氧化应激状态[21],一般认为生理水平的ROS 是细胞正常活动所必需的,它参与许多细胞事件包括细胞增殖、糖转运以及脂质合成等的调节。 但细胞内ROS生成超过一定的阈值,其可直接损伤细胞,诱导细胞死亡[22]。 本研究表明,经炒薏苡仁油干预48 h 后,能促进MCF-7 和ZR-75-1 细胞ROS 水平表达,并且相关氧化应激指标SOD、GPX 和CAT 的水平也显著上升,说明炒薏苡仁油可通过促进ROS 及其相关氧化应激指标的表达来促进细胞凋亡。
综上所述,炒薏苡仁油对乳腺癌MCF-7 和ZR-75-1 细胞具有抑制作用,其作用机制可能是促进ROS 及其相关氧化应激指标SOD、GPX 和CAT 的释放,并下调周期相关基因CDK4、CyclinA 和CyclinE的表达从而抑制细胞增殖,下调Bcl-2 和上调Bax基因的表达从而诱导细胞凋亡。 本研究仅对炒薏苡仁油抗乳腺癌的作用机制进行初探,如想进一步探讨薏苡仁炮制前后抗癌作用,还需从两者的化学成分、药理药效等方面进一步研究。