基于荧烷的一种化学反应型探针对S2-的识别研究

黄 昆

(西华师范大学化学化工学院四川南充 637002)

生活污水、工业废水等水体中含有的S2-极容易转变成剧毒和臭鸡蛋气味的H2S气体，给环境和安全造成危害。因此，水体中S2-浓度的监测是水质检测中的一项重要指标。目前监测S2-(H2S)的方法中，亚甲基蓝法和S2-选择性电极检测法为首要选择。但这些方法通常需将样品进行匀浆处理，对样品破坏性较大。有机小分子探针的出现及紫外、荧光无损分析检测技术的快速发展，建立了许多新的检测方法和手段[1-4]。反应型探针是近年发展起来的一类以化学反应为基础的探针。它通过目标分析物与探针特定基团之间的化学反应，引起探针反应前后光谱性能的变化，实现对目标分析物的高选择性、高灵敏性识别[5，6]。Wang课题组利用此方法首次设计合成一种将叠氮基引入丹磺酰胺荧光团中的H2S探针DNS-Az[7]，该探针可用于检测水溶液、血清和小鼠全血中的H2S。随后，Chang课题组报道了一系列基于叠氮官能团的氧杂蒽硫化氢探针SF1、SF2、SF4、SF5、AM、SF7-AM[8,9]。此外，Sun课题组设计了含双叠氮官能团的探针也能实现对S2-的高选择性响应，检测限为0.112 μmol/L[10]。近年来，基于类似机理设计的S2-(H2S)探针层出不穷，并在生物成像等领域展现出良好的应用前景[11,12]。

荧烷染料(Fluoran)是分子内含螺环内酯结构的比较有发展前途的第三代压、热敏染料。该类物质在熔点相对低的基质中和质子性显影剂共存时能发生热致褪色现象[13,14]。虽然它们与罗丹明B荧光染料有着极为相似的结构，也在印染业得到了较广泛的应用，但作为信号报告基团在识别领域的研究极少[15，16]。鉴于此，本文利用荧烷母体合成了一种新型比色探针Flu-S。通过S2-与探针叠氮基团之间的专一性化学反应，在含有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的0.001 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)中，实现了对S2-的高选择性光谱响应，检测限可达微摩尔级。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

Bruker micro TOF-QⅡ高分辨质谱仪，Bruker Avance Ⅱ 400核磁共振仪;岛津2550紫外-可见分光光度计；日立F-4600荧光分光光度计；恒温磁力加热搅拌器(巩义予华)；电子分析天平(上海力辰)；旋转蒸发仪(上海亚荣)。

化合物Flu参照文献方法[17]自制，熔点:178～180 ℃；4-二乙胺基酮酸、4-乙酰氨基酚、NaN3、还原型谷胱甘肽(GSH)、L-半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、苯硫酚(ArSH)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、Na2S、磷酸盐等试剂购自阿拉丁化学试剂(中国)公司，皆为分析纯。乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等溶剂购自成都科龙试剂公司，皆为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 Flu-S的合成称取Flu(386 mg,1 mmol)加入5 mL 10%HCl中，冰盐浴中冷却到-5 ℃以下。缓慢加入3 mL NaNO2(104 mg,1.5 mmol)溶液，维持温度在0 ℃以下，搅拌30 min。在此溶液中缓慢加入溶解了NaN3(98 mg,1.5 mmol)的3 mL溶液，并保持温度在0 ℃以下搅拌1 h。将混合溶液用二氯甲烷萃取3次(20 mL×3)，无水Na2SO4干燥，减压蒸馏除去溶剂后，将残留物通过硅胶柱层析提纯，洗脱溶剂为乙酸乙酯-二氯甲烷(体积比为1∶30)。得淡粉红色固体268 mg，产率：65.0%，熔点:98～100 ℃。

图1 Flu-S的合成路线Fig.1 The synthetic route of Flu-S

1.2.2 Flu-S的紫外吸收光谱测试将探针Flu-S溶于DMF中，配成浓度为0.005 mol/L的主体溶液，客体分析物配成0.01 mol/L的溶液。取探针溶液3/6 μL加入5 mL玻璃样品瓶中，用磷酸盐缓冲溶液(0.01 mol/L,pH=7.4，CTAB=0.001 mol/L)稀释成5/10 μmol/L的主体溶液。其中，CTAB的加入是为了加快反应速率[18]。在上述溶液中分别加入相同体积的客体离子溶液，放置30 min后进行光谱测试，在4 h 内完成测试。荧光光谱仪参数设置为：室温25 ℃下，激发波长为516 nm，激发和发射狭缝宽度分别为10 nm和20 nm。在1 cm的石英密闭比色皿中，以0.01 mol/L pH=7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS,含有0.001 mol/L CTAB)做参比。

2 结果与讨论

2.1 Flu-S的结构表征

1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:8.03(d,J=7.2 Hz,1H),7.69-7.60(m,2H),7.28(s,1H),7.18(d,J=7.4 Hz,1H),7.06(dd,J=8.8 Hz,2.7 Hz,1H),6.57(d,J=8.9 Hz,1H),6.46(d,J=2.3 Hz,1H),6.37(dd,J=8.8 Hz,2.6 Hz,2H),3.36(q,J=7.1 Hz,4H),1.18(t,J=7.1 Hz,6H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:169.47,152.92,152.48,149.87,149.18,135.10,134.92,129.89,128.92,127.03,125.22,124.06,121.23,121.07,118.76,118.08,108.76,104.59,97.70,83.61,44.63,12.62。HRMSm/z413.1615[M+H]+,Calcd.m/z413.1614[M+H]+。

2.2 Flu-S对S2-的识别性能研究

2.2.1 反应时间的选择响应时间是探针识别过程中一个重要因素，尤其是实时检测。实验考察了10 μmol/L探针在加入10倍量Na2S后紫外吸收光谱随时间的变化情况，如图2所示。在反应前10 min内，551 nm处的吸光度急剧增加，在10 min以后变化较小，20 min后探针与Na2S的反应速度趋于缓慢，30 min后基本完成。因此，选择30 min作为测试时间，所有测试在4 h内完成。

2.2.2 pH的影响为了解探针在复杂的生理环境中应用的能力，进一步考察了pH对探针识别性能的影响。10 μmol/L探针及探针在加入100 μmol/L的S2-后，在不同pH溶液中的吸收强度变化如图3所示。由图可知，探针在pH=4.0～8.0的范围内仍然能够很好地对S2-响应，这对探针在生理环境的应用具有重要意义。

图2 10 μmol/L Flu-S加入100 μmol/L Na2S后吸收强度(A551 nm)随时间的变化Fig.2 Absorption intensity (A551 nm) of 10 μmol/L Flu-S over time after the addition of 100 μmol/L Na2S

图3 不同pH对Flu-S选择性识别的影响Fig.3 The pH-dependent experiment of Flu-S

图4 Flu-S(10 μmol/L)以及Flu-S(10 μmol/L)中加入各种分析物(80 μmol/L)后的吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)Fig.4 Absorption (a) and fluorescence (b) spectra of Flu-S (10 μmol/L) and Flu-S (10 μmol/L) with the addition of various analytes (80 μmol/L)λex:516 nm,slit:10,20 nm;cell=1 cm

2.2.4 线性范围和检测限在PBS中5 μmol/L的探针与不同浓度的Na2S(0～100 μmol/L)作用后的紫外吸收光谱如图5A所示。在没加入Na2S之前探针溶液在551 nm左右的最大吸光峰强度较弱，溶液没有明显的颜色。随着S2-的加入，探针的最大吸收峰强度逐渐增大，溶液颜色逐渐转变成紫红色。当加入的S2-浓度达到约50 μmol/L时吸收强度达到最大值，吸收强度(A551)与S2-浓度(0～50 μmol/L)之间有良好的线性关系(图5A插图)，相关系数为0.9976。当加入S2-浓度超过50 μmol/L后，S2-浓度的继续增加不引起吸收强度的明显变化，说明探针与S2-之间的反应基本完成。将探针与8倍量S2-反应后的溶液进行质谱分析，发现m/z387.1707(理论值m/z387.1709[Flu+H]+)的吸收峰。研究表明探针与S2-作用后生成了化合物Flu(在水中螺环内酯开启)，即在S2-作用下探针叠氮基团被还原为氨基[4]。利用外推法[19]得探针对S2-的检测限为1.5 μmol/L，相关系数为0.9963，如图5B所示。

图5 Flu-S(5 μmol/L)中加入不同浓度Na2S(0～100 μmol/L)后的吸收光谱(A)及检测限(B)Fig.5 Absorption spectra of Flu-S(5 μmol/L) towards the incremental concentration of Na2S(0～100 μmol/L)(a) and the detection limit of Na2S(b)

2.3 实际样品中S2-检测

基于该探针在S2-检测中良好的选择性和灵敏度，将其应用到饮用纯净水(西华师范大学子露泉)、自来水(校内)和某化肥厂排放污水中S2-的检测。将浑浊的试样以3 000 r/min离心10 min,取上清液稀释。采用标准加入法进行分析，测定结果见表1，回收率在97.75%～102.16%之间。说明该方法的分析准确度较好，能够用于实际样品中S2-含量的检测。

表1 样品的分析结果Table 1 Analytical results of water samples

3 结论

合成了一种基于荧烷染料的反应型S2-(H2S)探针Flu-S。通过紫外吸收光谱、荧光发射光谱考察了Flu-S对S2-的识别行为。研究表明，Flu-S可在众多分析物中高选择地检测S2-，响应时间为30 min。机理研究证实Flu-S对S2-之间的选择性响应源于其与Flu-S分子中叠氮基团之间的专一性反应。将该方法用于纯净水、自来水及化肥厂污水中S2-的测定，回收率在97.75%～102.16%之间。该研究有助于拓展荧烷染料在化学传感器领域的应用。