黑纳豆固态发酵工艺优化的研究

于江淼，王家林，张海粟

(青岛科技大学 海洋科学与生物工程学院，山东 青岛 266031)

当前，在我国乃至世界上“三高”疾病已不足为奇，且大多数“三高”患者需要终身依靠药物来控制病情，这不仅给病人在身体上带来伤害，而且在经济上也是沉重的负担。在这种大环境下，一种可以缓解、控制病情，且不会产生副作用的非药物保健食品可以说是迫切需要的。纳豆是一种传统的发酵保健食品，由煮熟的大豆接种纳豆菌发酵制得[1]。纳豆含有多种生理活性物质，起到良好的扩张血管、溶解血栓的功效。其内特有的纳豆激酶是纳豆菌分泌的具有溶栓作用的一种丝氨酸蛋白酶，具有高效溶解血栓的作用，近年来受到国内外学者的广泛关注[2]。目前我国纳豆的研发生产还处于初级阶段，多以黄豆为原料且市场小，还需要认真攻关关键技术，完善生产工艺，并不断加大宣传，开拓市场。

黑豆相对于黄豆、大豆更具营养价值，本身含多种天然色素、皂苷、大豆球蛋白、亚油酸、亚麻酸和多种活性物质，更有养血平肝、补肾等药用价值[3]。本文以黑豆为原料，对其发酵工艺进行优化，进一步改善纳豆口味，获得高活性纳豆激酶的黑纳豆生产工艺条件。

1 材料与设备

1.1 材料

1.1.1 原料

黑豆：购自山东省青岛市四方利群集团股份有限公司；纳豆芽孢杆菌(BN-3-1)：筛选自日本滨梨纳豆。

1.1.2 试剂及培养基

试剂：纤维蛋白原和凝血酶，购于Sigma公司；尿激酶标准品，购于北京索莱宝科技有限公司；其他药品均为国产分析纯。

LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，pH 7.0～7.2。

1.1.3 主要仪器设备

高精密电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；手提式压力蒸汽灭菌器 浙江新丰医疗器械有限公司；LRH-250生化培养箱 上海一恒科技有限公司；洁净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；移液枪 大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；高转速离心机 北京京立离心机有限公司；精密恒温水浴槽 杭州雪中炭恒温技术有限公司。

2 试验方法

2.1 纳豆菌生长曲线的测定

本试验采用比浊法测定纳豆菌生长曲线，取实验室保藏的菌种进行活化，每隔3 h利用分光光度计测定二次活化后的纳豆菌液的光密度，测到第36 h为止，利用光密度值可知菌液浓度[4]。将测得的光密度值(OD660)与所对应的时间作图，可绘出纳豆菌的生长曲线，取对数生长期的菌液进行接种。

2.2 黑纳豆的制备工艺流程

精选黑豆→清洗→浸泡→蒸煮→接种→适当条件下发酵→冰箱中后熟→纳豆成品。

称取20 g优质黑豆，用清水清洗两三遍，除去黑豆表面杂质，加入60 mL去离子水，浸泡黑豆。将浸泡好的黑豆沥干水分，放进121 ℃高压蒸汽灭菌锅内蒸煮一定时间。煮熟的黑豆先进行冷却，冷却到70 ℃左右接种一定量的纳豆菌，搅拌均匀以保证豆子表面均匀沾满菌液。接种纳豆菌后的黑豆放入设定温度的恒温培养箱发酵一定时间[5]。将发酵好的黑豆进行冷藏，后熟7～8 h，即可得到成熟的纳豆。

2.3 纳豆激酶的提取

取发酵完成的黑纳豆，每份各2 g,加入2倍质量的无菌生理盐水中摇床30 min，将浸提液倒入离心管中，重复操作1次后，合并提取液，在转速为10000 r/min的离心机中离心10 min，收集上清液为纳豆激酶粗酶液。将研细的硫酸铵按照室温下20%的饱和度加入其中，混合均匀后置于4 ℃保存过夜，在转速为10000 r/min的离心机中离心30 min，收集上清液加入室温下饱和度70%的研细硫酸铵，混合均匀后再次在转速为10000 r/min的离心机中离心10 min，收集沉淀，取200 μL 0.1 mol/L PBS缓冲液溶解，冷藏备用。

2.4 纳豆激酶纤溶酶活的测定

本文采用魏嵘的方法测定纳豆激酶酶活并进行了一定改进[6]。利用紫外分光光度法测定纳豆激酶对模拟人体血栓的纤维蛋白的纤溶活力，并以尿激酶的纤溶活力作为标准。分别吸取10000 U/mL的尿激酶标准品溶液30，60，90，120，150 μL于微量离心管中，再分别加入120，90，60，30，0 μL的无菌生理盐水，配成浓度为2，4，6，8，10 U/μL的尿激酶标准品溶液。按表1中所需试剂依次添加，反应结束后分别于10000 r/min下离心20 min，收集上清液于280 nm下测定吸光度，以无菌去离子水调零，重复测定3次并绘制标准曲线，详细测定步骤见表1。

表1 尿激酶标准品及纳豆激酶样品纤溶活性测定方法Table 1 Methods for determination of fibrinolytic activity of urokinase standard samples and nattokinase samples

2.5 黑纳豆发酵工艺的单因素试验研究

根据黑纳豆发酵工艺的关键点设计浸泡时间、蒸煮时间、纳豆菌接种量、发酵温度、发酵时间5个因素，讨论其对纳豆发酵工艺的影响，每种因素设置5个不同水平，每次只对一个因素进行探究，其他因素严格控制统一[7]，不加说明的其他因素默认均取5个水平的中值，具体见表2。

表2 单因素试验Table 2 The single-factor experiment

对制备所得的纳豆进行纳豆激酶酶活测定和感官评价。参照尿激酶的酶活计算出纳豆激酶的酶活，以测得的最高酶活为满分值，其余酶活与其的比值乘以50，作为该纳豆的最终酶活得分。感官评价选择5个指标：形状、口感、气味、粘液、拉丝。评分标准：满分为50分，每项占10分，最差为0分，见表3[8,9]。其中测定拉丝长度时，先用干净的玻璃棒将纳豆搅拌均匀，然后将其挑起直至拉断，记录拉丝长度。

表3 纳豆感官评价标准Table 3 The sensory evaluation criteria of natto

2.6 黑纳豆发酵工艺的正交优化研究

根据单因素试验结果，选出对纳豆发酵工艺影响最大的4个因素，分别为发酵时间、蒸煮时间、发酵温度、接种量，并选出每种因素最优的3个水平，中间水平为最优，发酵的时间分别为18，21，24 h，大豆蒸煮的时间分别为30，40，50 min，选择发酵温度分别为37，39，41 ℃，纳豆菌的接种量分别为3%、4%、5%，进行四因素三水平的正交试验，分为9次不同水平组合的试验，试验方案见表4。对发酵完成的纳豆进行纳豆激酶纤溶活性测定和感官评价(见表3)，相关计算参照单因素试验的计算方法。

通过分析正交试验结果可以得到纳豆发酵工艺的最优条件，根据此条件进行黑纳豆的制作，并对优化后的纳豆进行纳豆激酶酶活测定和感官评价。

表4 正交试验方案Table 4 Orthogonal experimental scheme

3 结果与分析

3.1 纳豆菌生长曲线

对活化后的纳豆菌采用比浊法进行生长曲线的测定，结果见图1。

图1 纳豆芽孢杆菌生长曲线Fig.1 Growth curve of Bacillus natto

观察纳豆芽孢杆菌BN-3-1的生长曲线，发现其基本符合微生物生长周期的4个阶段，应接种15 h的纳豆菌，此时的纳豆菌正处于对数生长期。0～6 h为BN-3-1的调整期，6～15 h为BN-3-1的对数生长期，15～24 h为稳定期，并从24 h开始转为衰亡期。因此，选取对数生长期的15 h作为BN-3-1的最适发酵种龄。

3.2 尿激酶标准曲线

不同浓度的尿激酶标准液在37 ℃条件下水解纤维蛋白形成小肽片段和氨基酸，用三氯乙酸终止反应沉淀大分子蛋白，测定上清液的吸光度值，确定不同浓度尿激酶标准液的纤溶活性。以标准尿激酶纤溶酶活为横坐标，以△OD280为纵坐标作图，发现二者呈线性相关，其回归方程为y=0.0104x-0.0017，R2=0.9964，尿激酶标准曲线见图2。

图2 尿激酶标准曲线Fig.2 Standard curve urokinase activity

3.3 单因素试验结果

3.3.1 浸泡时间试验分析

图3 不同浸泡时间条件下的纳豆激酶纤溶活性Fig.3 Nattokinase fibrinolytic activity under different soaking time conditions

由图3可知，纳豆激酶的纤溶活性随着浸泡时间的增加呈现先缓慢升高再降低的趋势，分别为(3796.15±76.92)，(4238.46±58.75)，(4411.54±101.76)，(3937.18±96.79)，(3834.62±38.46) U/mg，换算成百分制的分数之后分别为39.47，44.07，45.87，40.94，39.87分。感官评价得分在趋势上与纤溶酶活性较为一致，分别为26，30，37，36，30分。这可能是因为浸泡时间不充分，黑豆未充分吸水，未能完全溶解营养基质以及营养物质的输送不到位，导致各部分传质不均匀的现象，拉丝物质少且黏性较差，限制了纳豆菌的生长繁殖[10]。当浸泡时间过长时，大豆吸水膨胀，空隙变小，纳豆菌发酵过程中得不到足够的氧气，也会影响纳豆激酶的活性。通过对纳豆激酶纤溶活性和感官的综合分析，得出在其他影响因素不变的条件下，在水中浸泡时间为15 h时发酵的黑纳豆最符合要求。

3.3.2 蒸煮时间试验分析

图4 不同蒸煮时间条件下的纳豆激酶酶活Fig.4 Nattokinase fibrinolytic activity under different cooking time conditions

由图4可知，纳豆激酶的纤溶活性随着蒸煮时间的增加显著升高后趋于平稳，分别为(2578.21±58.75)，(4411.54±101.76)，(4744.87±135.07)，(4667.95±123.64)，(4642.31±101.76)U/mg，换算成分数分别为26.81，45.87，49.33，48.53，48.27分，感官评价得分分别为26，37，38，29，25分。这可能是由于蒸煮时间延长，黑豆结构更加疏松，有利于营养物质的溶出和菌种的生长[11]。但蒸煮时间过长会破坏黑豆的营养物质，反而不利于纳豆菌的生长繁殖，通过对纳豆激酶纤溶活性和感官的综合分析，同时考虑能耗问题，得出在其他影响因素不变的条件下，蒸煮时间为30 min时发酵的黑纳豆最符合要求。

3.3.3 接种量试验分析

图5 不同接种量条件下的纳豆激酶酶活Fig.5 Nattokinase fibrinolytic activity under different inoculum amount conditions

由图5可知，纳豆激酶的纤溶活性随着接种量的增加显著升高后又缓缓下降，分别为(3411.54±66.62)，(4411.54±101.76)，(4642.31±135.07)，(4546.15±101.76)，(4488.46±44.41)U/mg，换算成分数分别为35.47，45.87，48.28，47.06，46.47分，感官评价得分分别为21，24，37，38，26分。这可能是由于接种量较小，菌液不能均匀贴附在黑豆表面，需要较长时间繁殖积累，从而延长发酵时间，不易充分发酵；而接种量过大，纳豆菌种会因为生长过快消耗大量营养物质，导致菌体缺氧，生长速度下降[12]。通过对纳豆激酶纤溶活性和感官的综合分析，得出在其他影响因素不变的条件下，接种量为3%时发酵的黑纳豆最符合要求。

3.3.4 发酵温度试验分析

图6 不同发酵温度条件下的纳豆激酶酶活Fig.6 Nattokinase fibrinolytic activity under different fermentation temperatures conditions

由图6可知，纳豆激酶的纤溶活性随着发酵温度的增加显著升高后趋于平稳，分别为(1962.82±58.75)，(2821.79±44.41)，(4411.54±101.76)，(4539.74±117.50)，(4526.92±115.38)U/mg，换算成分数为20.41，29.34，45.87，47.20，47.07分，感官评价最终得分为20，24，36，37，29分。在发酵过程中发酵温度影响菌体的各种酶促反应和蛋白质的合成，物料和产物的物理性质也随之变化。开始随着温度的升高，可以使反应速度增大，菌体生长速度增大，达到37 ℃后略有增加并趋于稳定。发酵温度达到41 ℃时，虽然纤溶酶活没有显著降低，但是从感官评价来看，黑豆表面暗沉，拉丝物质明显，粘度变低，长度明显变小，可能是由于纳豆发酵过程中物料中心的热量无法散出，不利于菌体的生长[13]。通过对纳豆激酶纤溶活性和感官的综合分析，得出在其他影响因素不变的条件下，发酵温度为39 ℃时发酵的黑纳豆最符合要求。

3.3.5 发酵时间试验分析

由图7可知，纳豆激酶的纤溶活性随着发酵时间的增加显著增加后有一定回落，分别为(3616.67±88.82)，(4411.54±101.76)，(4629.49±80.06)，(4808.97±96.79)，(4706.41±117.50)U/mg，换算成分数为37.60，45.87，48.13，50.00，48.93分，感官评价得分随着发酵时间的推移，变化更为显著，分别为25，36，37，32，28分。可能是由于发酵时间较短，微生物不能完全利用黑豆的营养物质生长繁殖，而过长的发酵时间会造成纳豆老化，降低观感，同时纳豆激酶活力降低[14]。通过对纳豆激酶纤溶活性和感官的综合分析得出在其他影响因素不变的条件下，发酵时间为21 h时发酵的黑纳豆最符合要求。

图7 不同发酵时间条件下的纳豆激酶酶活Fig.7 Nattokinase fibrinolytic activity under different fermentation time conditions

3.4 正交试验结果

3.4.1 正交试验分析

正交试验发酵的纳豆所测得的纳豆激酶纤溶活性及感官得分见表5。

表5 正交试验结果Table 5 Results of orthogonal experiment

正交试验分析见表6。

表6 正交试验分析Table 6 The orthogonal experimental analysis

续 表

对纳豆发酵影响最大的4个因素及3个最优水平进行正交试验，由试验结果分析可知，不同条件对纳豆发酵工艺的影响力大小结果为：发酵温度>接种量>发酵时间>蒸煮时间，并且得到最优的发酵条件为发酵时间18 h，蒸煮时间30 min，发酵温度37 ℃，纳豆菌接种量4%，浸泡时间15 h。

3.4.2 优化纳豆品质分析

优化前的黑纳豆见图8，优化后的黑纳豆见图9。

图8 未优化的黑纳豆Fig.8 The unoptimized black natto

图9 优化后的黑纳豆Fig.9 The optimized black natto

由图9可知，经优化后的黑纳豆颗粒完整、饱满、有光泽，拉丝物质均匀附着在黑豆表面，搅动后拉丝长度可达到32 cm，不易断裂。口感软糯绵密，没有氨味，与优化前差异极大。

优化后黑纳豆的各项指标见表7，通过直观数据可知，优化后黑纳豆的纳豆激酶纤溶活性和感官评价比单因素试验和正交试验所发酵的纳豆品质高，说明该条件可作为黑纳豆发酵工艺的最优组合。

表7 优化后黑纳豆的各项指标Table 7 The indicators of black natto after optimization

4 结论

本课题从原料入手对纳豆这种保健食品进行改良，以优质黑色大豆为原料，通过单因素试验和正交试验对黑豆纳豆的发酵条件进行了优化，最终得出黑纳豆的最适宜发酵条件为：在水中浸泡时间15 h、蒸煮时间30 min、纳豆芽孢杆菌接种量4%、发酵温度37 ℃、发酵时间18 h。优化后黑纳豆的外观和口味都得到了一定的改良，并提取了较高的纳豆激酶纤溶活性。

随着社会经济不断发展，物质条件不断丰富，人们对于衣、食、住、行等生活条件的要求与生活方式更趋于健康、绿色、环保，纳豆特别是黑豆纳豆将被越来越广泛的人群所熟知与接受，拥有更加广阔的市场与前景，将会变为我国保健食品工业方面新兴的领军产品[15]。本研究的目的在于改善纳豆食品的质量，加快纳豆食品在中国市场的推广，有效地降低我国“三高”人群的数量。