石榴皮提取物的抑菌活性及其对冷却鸡肉保鲜效果

洪军，李文玉，卫夏怡，吉冰洁，王少霞，毛锐

(河南城建学院 生命科学与工程学院 河南省水体污染防治与修复重点实验室，河南 平顶山 467036)

随着人们生活水平的不断提高和安全营养食品的兴起，人们越来越强调食品的纯天然性和安全性。但肉类食品和调味品的防腐保鲜方面大多还是以添加化学防腐保鲜剂为主[1]，因此，寻求绿色、天然、安全的食品防腐保鲜剂以减少食源性致病菌的污染显得尤为重要。作为生物源的食品防腐保鲜剂和调味品主要来源于微生物和动植物的天然产物，如Nisin、壳聚糖、迷迭香提取物、香辛料提取物等[2,3]。

迷迭香是一种重要的唇形科香草植物，主要含有鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚等活性物质。因具有较强的抗氧化和抗菌特性，迷迭香及其提取物被广泛地应用于肉制品、果蔬、水产品等食品防腐保鲜领域以及功能性食品和调味品中等[4]。石榴皮作为一种中药材，其活性物质主要包括多酚、黄酮、生物碱等[5]，石榴皮提取物具有很好的抗氧化、清除自由基、抑制脂质过氧化和广谱的抗菌功效，可用于水果、植物油、肉类和调味品酱油等中起到防腐保鲜作用[6-8]。Zhuang等研究表明，石榴皮提取物能延缓感官品质和肉色的恶化，抑制腐败菌的生长，并能降低TVB-N的含量和ATP相关化合物的降解，使鱼片的货架期延长2 d左右，有望成为一种有前景的水产品防腐剂。贲浩使用石榴皮单宁、柚皮苷、大蒜素等复合保鲜剂作用于冷却鸡肉将其保鲜期延长至4 d[9]。覃宇悦等研究表明壳聚糖-石榴皮提取物复合膜是一种兼具抗菌和抗氧化效果的保鲜膜，能有效延长猪肉饼的保质期，较单一组合效果好，并能改善猪肉饼的品质[10]。

这些包含石榴皮的保鲜剂作用于冷却肉中保质期较短，有些制备工艺较复杂，为了更好发挥其防腐保鲜作用，本研究拟通过石榴皮醇提物对5种食源性致病菌的抑菌作用进行分析，选择适宜浓度进行单一或与其他生物源天然保鲜剂复合作用于冷却鸡肉，观察其保鲜效果，为石榴皮复合保鲜剂的应用提供了理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

供试药物：石榴皮，购于平顶山市新城区国大药房中药材店；脂溶性迷迭香提取物、壳聚糖、Nisin，购于试剂公司。

供试菌种：肠炎沙门氏菌肠炎亚种ATCC14028、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115、李斯特氏菌、大肠杆菌ATCC25922、副溶血性弧菌ATCC17802，河南城建学院生科院课题组保存。

主要仪器：高速粉碎机、超声波清洗仪、旋转蒸发仪、生化培养箱、自动凯氏定氮仪、紫外分光光度计、pH计等。

1.2 石榴皮的提取及抑菌实验

1.2.1 石榴皮提取物制备

超声辅助醇提物制备：将石榴皮烘干，用高速粉碎机粉碎并过60目筛，称取适量药粉，按1∶25的料液比加入60%的食用乙醇，在200 W、50 ℃条件下超声1 h，重复2～3次，然后真空抽滤，收集滤液[11,12]。

超声辅助水提物制备：称取适量药粉，按1∶25的料液比加入蒸馏水，在200 W、70 ℃条件下超声1 h, 然后将提取液用真空抽滤除去药渣，并收集滤液。

在pH 2、温度35 ℃条件下，用2%～3%活性炭脱色35 min，将过滤后的提取液减压旋转蒸发浓缩至1 g/mL。使用前在200 W、40 ℃条件下超声除菌30 min，4 ℃冰箱保存备用。此浓度计算方法为石榴皮质量/浓缩液体积。

1.2.2 体外抑菌实验

分别取100 μL活化好的食源性致病菌(肠炎沙门氏菌肠炎亚种ATCC14028、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115、李斯特氏菌、大肠杆菌ATCC25922以及副溶血性弧菌ATCC17802)稀释至菌液浓度为107CFU/mL进行涂布。然后用打孔器在标记的位置进行打孔，在孔内加入制备好的80 μL药液(石榴皮单一提取物或与其他食品添加剂复合物)，放入37 ℃培养箱中培养20～24 h，每组设3个平行，测定抑菌圈的直径。抑菌圈直径=测量所得直径-打孔器直径(8 mm)。

1.3 石榴皮提取物对冷却鸡肉保鲜测定

1.3.1 保鲜剂组成及制备方法

第一组：0.025 g/dL Nisin+1 g/dL壳聚糖(溶解于1%的醋酸溶液中)+0.03 g/dL迷迭香提取物+0.25 g/mL石榴皮粗提物；配制方法：取1 g/mL石榴皮提取物25 mL，依次加入0.03 g脂溶性迷迭香提取物干粉、0.025 g Nisin，搅拌均匀后，再加入用1%醋酸完全溶解的壳聚糖溶液，余量用无菌水补充即制备成复合保鲜剂。用前在200 W、40 ℃条件下超声除菌30 min。

第二组：0.25 g/mL石榴皮粗提物；对照组：无菌水。

1.3.2 肉样处理方法及指标测定

取新鲜鸡胸脯肉在6～8 h内将鸡肉中心温度冷却至4 ℃，将配制好的复合保鲜剂均匀涂抹于肉样表面，超净工作台紫外照射30 min，用无菌纱布吸干多余的水分，然后用无菌真空包装袋进行包装，于4 ℃冰箱保存。每组设3个平行，分别在第0，2，4，6，8，10，12，14，16，18天取样进行感官评定、TVB-N、TBARS、pH值、微生物总数测定。感官评定参照GB 2707-2016进行，评价表见表1；TVB-N的测定参照GB 5009.228-2016进行；TBARS的测定参考范碧琴[13]的方法进行；pH值的测定参考Wulf等[14]的方法进行，参考标准：新鲜肉pH 5.8～6.2，次鲜肉pH 6.3～6.6，变质肉pH>6.7；微生物指标的测定参照GB 4789.2-2016进行。

表1 感官评定表Table 1 Sensory evaluation

1.4 数据分析

所有数据均为3 次重复实验计算得出，结果由平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 抑菌实验结果与分析

表2 石榴皮水提物对5种食源性致病菌的抑菌圈大小Table 2 Inhibition zone size of water extracts from pomegranate peel on five food-borne pathogenic bacteria

表3 石榴皮醇提取物对5种食源性致病菌的抑菌圈大小Table 3 Inhibitory zone size of alcohol extracts from pomegranate peel against five food-borne pathogenic bacteria

由表2和表3可知，1 g/mL浓度的石榴皮水提物对5种食源性致病菌均有抑菌作用，但较同浓度的醇提物效果差，此结果表明不同提取方法对抑菌作用不同，可能是提取物中所含的主要成分有差别引起的。石榴皮醇提物除了对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.5 g/mL外，其余4种菌的MIC为0.25 g/mL。此结果与熊素英等通过不同方法获得的石榴皮水、醇提取液对细菌、酵母、霉菌均有抑菌效果,对细菌的抑制效果最好，醇提物抑菌效果优于水提物，最低抑菌浓度为50%相一致[15]。为了达到更好的保鲜效果，将石榴皮醇提物分别与迷迭香、壳聚糖、Nisin进行复合，观察其抑菌活性，结果表明石榴皮醇提物能与其他3种物质进行混合，无明显拮抗作用，且有一定的叠加协同效果，见表4。

表4 石榴皮提取物与其他天然保鲜剂复合后对5种食源性致病菌的抑菌圈大小Table 4 Inhibition zone size of pomegranate peel extractscombined with other natural preservatives on fivefood-borne pathogenic bacteria

续 表

2.2 不同提取物对冷却鸡肉保鲜效果

2.2.1 不同处理组对鸡肉冷藏期间TVB-N值的影响

TVB-N(挥发性盐基氮)指动物性食品由于酶和细菌的作用，在肉类腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质，TVB-N含量是衡量肉类腐败变质的重要指标之一，表明TVB-N含量越高，肉类新鲜度越低。

图1 不同处理组对鸡肉冷藏期间TVB-N值的影响Fig.1 Influence of different treatment groups on TVB-N values of chicken during refrigerated storage

由图1可知，随着冷藏时间的延长，各组数值也在逐渐增大，在第8天对照组的TVB-N值已经超过国家规定的鲜肉标准(15 mg/100 g)，第二组(单一石榴皮粗提物)则在第12天时已经超过鲜肉标准，第一组在第18天时仍小于15 mg/100 g，表明第一组对于TVB-N数值的增长有良好的抑制作用。此结果表明，含石榴皮粗提物复合组的保鲜效果较单一石榴皮粗提物好。

2.2.2 不同处理组对鸡肉冷藏期间TBARS值的影响

图2 不同处理组对鸡肉冷藏期间TBARS值的影响Fig.2 Influence of different treatment groups on TBARS values of chicken during refrigerated storage

由图2可知，随着时间的延长，各组的肉样均发生了不同程度的脂肪氧化，对照组的TBARS值增长最为明显，第6天时对照组值为0.603 mg/100 g，超过了鲜肉标准0.5 mg/100 g，而第一组的TBARS值仅为0.3 mg/100 g，直至第16天超过鲜肉标准；第二组在第8天时为0.504 mg/100 g，超过鲜肉标准。此结果表明，0.25 g/mL石榴皮提取物具有一定的抗脂肪氧化能力，较对照组延长2 d以上，但是与其他添加剂配合效果更佳，可延长10 d左右。

2.2.3 不同处理组对鸡肉冷藏期间pH值的影响

图3 不同处理组对鸡肉冷藏期间pH值的影响Fig.3 Influence of different treatment groups on pH values of chicken during refrigerated storage

由图3可知，在鸡肉冷藏初期，各组的pH值均有一定下降，对照组从第4天开始上升，各处理组均从第6天开始上升，对照组的数值明显大于各处理组，在第8天时超出一级鲜肉标准(5.8～6.2)，由于存在壳聚糖溶解在1%醋酸的保鲜剂配方可能会对pH值产生一定的影响，第一组的pH值相对各组一直较低，在第12天时开始呈下降趋势。这可能是因为鸡肉在贮藏初期，大量的乳酸和磷酸的酸性物质的产生导致pH值下降。而随着贮藏时间的増长，由蛋白质降解产生的多肽及氨基酸的增多导致pH值上升，上升程度代表着肉类的变质程度。此结果表明，实验组均较对照组效果好，但石榴皮复合保鲜剂效果更佳。

2.2.4 不同处理组对鸡肉冷藏期间菌落总数的影响

图4 不同处理组对鸡肉冷藏期间菌落总数的影响Fig.4 Influence of different treatment groups on total number of bacterial colony of chicken during refrigerated storage

由图4可知，在鸡肉冷藏期间，菌落总数一直呈持续增长状态，对照组的数据增长趋势明显大于处理组，第8天对照组的菌落总数为1.9×106CFU/g，已超过鲜肉菌落总数的判定标准(106CFU/g)，第二组在第10天时超过了判定标准，而第一组的菌落总数相对较小，可知石榴皮复合保鲜剂相对单一石榴皮保鲜剂在肉样上的抑菌效果更好。分析原因可能是石榴皮中的多酚类物质、黄酮类物质等抑制了部分细菌的生长，但是与Nisin、壳聚糖和迷迭香复合后，充分发挥了4种成分间协同增效的作用，更好抑制了微生物的生长，也抑制了蛋白质的分解速度，此结果也与TVB-N含量、感官评定的结果相吻合。

2.2.5 冷却鸡肉贮藏期间感官评定结果

随着肉类放置时间的延长，肉类在腐败变质时，因其组织成分的分解，使肉在色泽、气味、弹性、粘度方面发生异常，感官质量明显下降。因感官指标的变化要早于理化指标和微生物指标，因此感官指标的变化状况可以作为肉质量标准的重要依据。

表5 冷却鸡肉贮藏期间感官评定结果Table 5 Sensory evaluation results of chicken during refrigerated storage

由表5可知，在各组的感官评定结果中，第一组综合评定结果要优于其余各组，其次是单一石榴皮(第二组)。但因石榴皮提取物中含有一定的颜色，目前脱色效果不够理想，对肉的色泽稍微有影响，但复合保鲜剂第一组在气味、弹性方面明显优于对照组。第8天时对照组已经出现明显的腐败臭味，肉色暗红，表面粘手，肉色弹性很差；随着保存时间的延长，第二组的各项感官评定结果也逐渐下降，由此可知在各处理组中第一组的保鲜效果较好。

3 结论

由体外抑菌实验可知，石榴皮粗提物单一或复合物均对5种食源性致病菌的抑菌效果较好，且与其他生物源食品添加剂具有一定的协同作用。石榴皮复合物对冷却鸡肉的保鲜效果明显优于对照组和单一石榴皮提取物，可将保鲜期延长10～12 d，0.25 g/mL石榴皮粗提物组将保鲜期延长4～5 d。此天然复合保鲜剂充分利用了各天然防腐保鲜剂的抑菌性、抗氧化性和成膜性，充分发挥了保鲜剂之间的协同增效作用，不仅可以增强其保鲜效果，而且具有调味增香、营养保健功能，延长了产品货架期，从而减少其对冷却肉品质的影响，提高其应用的安全性。根据此复合配方的功能，也可应用于调味品的防腐保鲜。