许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道微生物群结构特征

姜 燕，曹亚男，柳学周，徐永江，李德军，史 宝，王 滨

( 1.中国水产科学研究院 黄海水产研究所，农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室， 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071； 2.烟台市海洋经济研究院，山东 烟台 264000； 3.青岛市黄岛区渔业技术推广站，山东 青岛 266400 )

微生物存在于环境的每一个角落，与人类的生活息息相关。据统计，在人体肠道中居住着数以万亿计的微生物[1]。微生物在肠道的大环境中以其内容物为基质进行发酵，能够分泌产生维生素、氨基酸、酶等多种有用代谢产物，在满足自身生长繁殖需求的同时还能促进宿主对营养物质的消化吸收[2-6]。并且，肠道内的微生物能够通过产物抑制、营养竞争等多种方式阻止外来菌群的定殖，有效维持肠道微生物群的动态平衡，预防疾病的发生。因此，肠道微生物群对宿主的营养、免疫等方面均发挥着重要作用[7-9]。有研究指出，肠道菌群与宿主内分泌系统间的相互作用能够明显影响宿主的行为和生理活动[10-11]。

水产动物属低等动物，容易受水环境、养殖工艺、地理位置等外界因子的影响，造成自身的不稳定性，形成明显的个体差异，研究起来相对困难。目前，对水产动物肠道菌群的研究主要集中于菌群结构、主要影响因素及益生菌调控等方面[12-16]。研究表明，营养水平[5,17]、生理阶段[18]、药物[19-20]及外界环境胁迫[21]等均能够不同程度地改变肠道菌群的组成信息。李存玉等[22]对池塘和工厂化养殖褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)肠道菌群组成进行细致研究，发现养殖模式的不同也会对肠道菌群结构产生一定的影响。而针对菌群结构在海水鱼肠道中发生、发育过程的报道相对较少，主要集中在工厂化人工繁育条件下的鲆鲽类[23-24]。在灵长类的研究中，有报道指出，相对于饮食而言，由演化趋势形成的宿主本身的差异才是影响肠道菌群的主要因素[25]。同样，鱼种类的不同，其肠道菌群结构也存在显著差异，而其仔、稚鱼肠道菌群结构的形成过程也必然不同。

许氏平鲉(Sebastesschlegelii)因其生长快、抗病性强、营养价值较高等优点迅速成为我国沿海各省海水养殖的主要经济鱼种之一[26]。近几年，其苗种繁育技术也得到相应的完善，以确保下游产业链的可持续发展。笔者运用16S rDNA高通量测序的方法，针对苗种繁育期的许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道菌群结构开展分析，并揭示早期苗种发育阶段肠道的核心菌群及其定殖规律，为许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼益生菌的筛选及肠道菌群调控提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验用许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼的培育

将同一批受精卵孵化的许氏平鲉仔鱼随机分布于5.0 m×5.0 m×1.0 m的育苗池中，随机挑选3个育苗池作为平行组。试验期间育苗池严格按照试验车间的操作规范进行，其中，水温18～20 ℃，溶解氧>5 mg/L，盐度30，氨氮质量浓度<0.1 mg/L。

试验用仔鱼在3日龄开口，之后开始添加褶皱臂尾轮虫(Branchionusplicatilis)。3～15日龄投喂轮虫，12～45日龄投喂中国卤虫(Artemiasinica)无节幼体，40日龄开始逐渐添加配合饲料，随着幼鱼的生长，逐渐更换配合饲料的规格。

1.2 样品采集

依据文献[27-28]关于仔鱼、稚鱼、幼鱼阶段的划分方法，分别对体表无任何病症的健康的1日龄仔鱼、9日龄稚鱼、20日龄稚鱼、54日龄幼鱼、95日龄幼鱼进行样本采集，作为试验用鱼。其中，在1日龄和9日龄时，分别自每个育苗池采集50尾仔鱼及稚鱼，20日龄时分别采集30尾，54日龄时分别采集10尾，而95日龄时则分别采集5尾。将选取的仔鱼、稚鱼、幼鱼进行12 h的饥饿处理，之后于灭菌海水中浸泡20 min，连续处理3次，消除体表微生物的污染。采用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(Fluka, USA)麻醉，用75%酒精擦拭体表，于无菌环境下解剖并取出肠道，去除内容物后用预冷的无菌生理盐水冲洗，并于液氮中保存备用。由于1日龄仔鱼肠道分化不明显，因此将整个仔鱼用于后续肠道微生物群研究。

以G1、G9、G20、G54、G95表示不同日龄仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道样品，而G1.1、G1.2、G1.3则分别代表G1组中的3个平行，其余日龄肠道样品组同。

另从养殖场周围海域收集3尾野生许氏平鲉，体质量为(205±32) g，分别记以WG1、WG2、WG3。同样，野生个体经过12 h的饥饿处理与麻醉后无菌解剖取其肠道，后续处理同仔稚鱼肠道样品。

1.3 微生物总DNA提取与测序

将液氮保存的仔稚幼鱼肠道样品取出，冰上自然解冻，按照QIAamp DNA mini kit(QIAGEN, Germany)试剂盒的说明书提取微生物总DNA。PCR扩增16S rDNA的V3～V4可变区序列，扩增基因的引物为343F(5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)和798R(3′-AGGGTATCTAATCCT-5′)。扩增的序列经琼脂糖凝胶电泳检测后交由商业测序公司通过Illumina MiSeq PE300平台进行高通量测序。

1.4 数据处理与分析

测序所得的下机数据，采用Trimmomatic(v 0.35)[29]剪切、Flash(v 1.2.11)[30]拼接、Uchime(v 4.2)[31]去嵌合体等一系列处理得到有效序列。然后，采用Vsearch(v 2.4.2)[32]对所有样品的全部有效序列进行归类操作，默认以97%的一致性将序列聚类成为运算分类单元，并选取运算分类单元的代表性序列。用RDP Classifer(v 2.2)[33]与Silva数据库(v 123)[34]对运算分类单元代表序列进行物种注释。

采取单因素方差分析方法比较各时期样品菌群结构间的差异，显著性水平为0.05。所有数值均以平均值±标准差表示。

2 结 果

2.1 测序结果

将下机所得测序数据经过剪切、拼接、进一步质控、去嵌合体等一系列处理后，试验样品总共获得385 205条有效序列，经聚类分析得到1039个运算分类单元，注释后获得667个属。仔鱼及稚鱼生长发育阶段肠道微生物测序结果的统计分析见表1，1日龄的初孵仔鱼体内属水平的微生物种类为138.0，随仔鱼生长出现先降后升趋势，并在54日龄(155.0)时出现最高值，而在95日龄时急剧下降。

2.2 仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道菌群分布规律

对生长发育阶段仔鱼、稚鱼、幼鱼及野生个体肠道中相对丰度高于1%的菌群进行对比分析，发现初孵仔鱼肠道中丰度高于1%的菌群丰度之和为81.4%(图1)。在整个追踪过程中，这一丰度和呈下降—上升—下降趋势，在95日龄时出现最低值(62.0%)。而在野生个体的肠道中，相对丰度高于1%的菌属丰度之和的平均值为86%，远高于54日龄和95日龄幼鱼的平均值(73.5%)。此外，不动杆菌属(Acinetobacter)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Massilia和Limnobacter始终存在于仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道内，并且不动杆菌是仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道中的优势菌属，其丰度为26.2%～45.3%。而野生个体肠道中则无共有的优势菌属。

在不同样本肠道微生物群的主成分分析中，主成分1和主成分2的贡献率分别为60.1%和20.2%(图2)。由此可见，相对于野生个体，许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道样品分布相对聚集，表明菌群组成较为相近；而对不同日龄仔鱼、稚鱼、幼鱼来说，54日龄鱼肠道菌群分布与1日龄的最相近。

2.3 仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道核心菌群

以各取样点3个平行样本共有菌属为基础，将不同生长阶段的仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道菌群在属水平上的共有情况进行分析，随着鱼体增长，各取样点肠道特有菌属数目分别为8、7、5、34、8(图3)，5个阶段中每相邻两阶段的共有菌属分别为46、48、48、53，而整个试验周期内鱼肠道的共有菌群为36个，说明在整个追踪时期这36个菌属始终存在于仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道内。

在这36个共有属中，相对丰度高于1%的菌属有芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、鞘氨醇单胞菌属、贪铜菌属(Cupriavidus)、Massilia、Limnobacter、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、弧菌属(Vibrio)、不动杆菌属。将这11个菌属作为仔稚幼鱼肠道的核心菌群，并对其丰度随鱼体生长发育的变化趋势进行分析(图4)。由于1日龄的初孵仔鱼肠道未分化，研究过程采用的是整个鱼体，因此在对核心菌群分析时自9日龄开始。其中，芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、不动杆菌属、根瘤菌属、鞘氨醇单胞菌属、贪铜菌属、Massilia和寡养单胞菌属的丰度随仔鱼、稚鱼、幼鱼生长整体呈现先升后降的趋势，这8个菌属均在54日龄时出现最高值，分别为1.42%、13.59%、45.28%、1.26%、2.79%、0.93%、8.29%、8.99%；弧菌属则为先逐渐下降后迅速上升的趋势(0.37%～12.41%)，54日龄时丰度最低；Limnobacter和假交替单胞菌属整体则呈现下降趋势。同时，在这些核心菌群的演变趋势中，芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、不动杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和弧菌属的丰度变化较为明显。

表1 苗种繁育阶段许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道微生物测序数据统计分析(n=3)Tab.1 Statistics of sequencing data for microflora in intestines of black rockfish during the early life stage

图1 许氏平鲉苗种繁育早期仔鱼、稚鱼、幼鱼与野生鱼体肠道中相对丰度大于1%的菌属Fig.1 The composition of genera with abundance higher than 1% in intestines of larval and juvenile and wild black rockfish

图2 许氏平鲉肠道中微生物群的主成分分析Fig.2 The principal components analysis (PCA) of microbiota in intestines of black rockfish larva and juvenile

图3 许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道共有微生物群分析Fig.3 The analysis of shared microbiota among black rockfish larva and juvenile intestines

2.4 人工繁育仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道与野生个体肠道微生物群的共有菌群分析

14个菌群既存在于人工繁育仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道(表2)，又存在于野生个体肠道中，表明这些菌群可能一直存在于许氏平鲉的肠道内。在这些菌群中，不动杆菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、Massilia、根瘤菌属、鞘氨醇单胞菌属、寡养单胞菌属和弧菌属为仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道的核心菌群；同时，不动杆菌属和鞘氨醇单胞菌属也是野生个体中相对丰度大于1%的属。另外，仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道中短芽孢杆菌属、Massilia的最小丰度值分别是野生个体肠道中最大丰度值的9倍、32倍，差异较大。但是，核心菌群中的Limnobacter和假交替单胞菌属却不存在于野生个体中。

图4 许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼生长过程中肠道核心菌群相对丰度的变化规律Fig.4 Changes in relative abundance of core microbiota in intestines of black rockfish larva and juvenile during the developmental stage

表2许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道与野生个体肠道共有菌群%

Tab.2 Shared microbiota in intestines of larva and juvenile and wild black rockfish

3 讨 论

3.1 许氏平鲉肠道微生物群结构分析

初孵仔鱼未开口不能摄食，因此养殖环境中的微生物对其影响较小，1日龄仔鱼体内微生物主要来自于亲本或受精过程的环境微生物。而轮虫、卤虫是营养物质、微生物等的天然生物载体，其体内携带大量微生物。并且，轮虫、卤虫这类的鲜活生物饵料在海水鱼苗种繁育早期一般是现营养强化现用，尤其是轮虫，一般是现用现买，每批次的微生物品质不能保证完全一致。因此，不同批次的生物饵料，其携带的微生物组成都会存在一定的差异。而健康苗种肠道内的微生物群维持在动态的平衡中，仔鱼、稚鱼摄食轮虫后其肠道内的定殖微生物群与饵料中的菌群之间存在一定的竞争，包括黏附位点竞争、营养竞争等。通过这些竞争作用，外源微生物难以在肠道中定殖而被排出体外；同时，受微生物间相互作用的影响，肠道内的微生物群结构发生一定转变，从而表现出与1日龄的初孵仔鱼相比，9日龄稚鱼肠道微生物属水平物种数目及相对丰度高于1%的属的丰度之和出现一定的波动。卤虫体内虽然也携带大量微生物，但是与轮虫的明显不同[23,35]。因此，随着卤虫的逐渐添加，鱼肠道菌群结构也随之发生改变。卤虫投喂时间相对较长(12～45日龄)，40日龄后开始添加配合饲料，在54日龄和95日龄完全配合饲料期，肠道菌群结构的变化仍然比较大。并且，在54日龄时幼鱼肠道的特有菌属明显比其他时期的多。推测可能是由于生物饵料对仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道菌群的影响具有一定的持续性，再加上随鱼生长其生理功能在不断完善，肠道对内部菌群逐渐形成一定的选择性造成的。但是，随着幼鱼对配合饲料的不断摄入，95日龄时肠道的特有菌属又明显下降；同时，54日龄和95日龄肠道的共有菌属明显升高。这也反映出幼鱼肠道微生物群对配合饲料的逐渐适应及其肠道菌群组成逐渐稳定。

人工繁育仔稚幼鱼肠道中相对丰度高于1%的菌属与野生个体中的差异较大；同时，不同时期的仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道共有菌群36个，而与野生个体肠道仅有14个共有菌属；并且，短芽孢杆菌属、Massilia在仔鱼、稚鱼肠道中的最小丰度值分别是野生个体肠道中最大丰度值的9倍、32倍，说明生存环境是许氏平鲉肠道菌群结构发生变化的一个重要因素[36]。在不同饵料阶段核心菌群中的芽孢杆菌属、不动杆菌属和弧菌属等的丰度变化比较明显，反映出饵料对仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道菌群结构具有一定的影响。研究表明，饲料组分的变化能够影响鱼体肠道微生物群的组成、分布及丰度等特征[37-39]。也有报道[15,35,40]指出，人为添加微生物(益生菌)可以改变甚至优化宿主肠道菌群结构。但Bakke等[14]研究发现，通过饵料进行微生物的添加对大西洋鳕(Gadusmorhua)幼鱼肠道微生物群结构的影响较小，这可能与试验鱼的种类、生理阶段及试验条件的设计有关。

3.2 许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道核心菌群分析

本研究中，1日龄的初孵仔鱼体内弧菌含量为0.37%，开口摄食生物饵料后，在9日龄时其丰度迅速增加并成为优势菌属。但是，试验用仔鱼、稚鱼、幼鱼均为体表、肠道正常并无任何生理学病征的健康仔鱼、稚鱼、幼鱼，这与对大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、褐牙鲆、庸鲽(Hippoglossushippoglossus)的仔鱼、稚鱼开口前后肠道中弧菌属丰度的变化规律相似[23-24,41]。但是，在仔鱼、稚鱼、幼鱼摄食生物饵料后的整个苗种繁育过程中，弧菌属的演替规律为先降后升；并且，许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道中最优势的菌属并不是弧菌，而是不动杆菌属。此外，不动杆菌属及其他大部分的核心菌群在许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼发育过程中整体呈先升后降趋势，并在54日龄时丰度最高。这也是与鲆鲽类明显不同的地方。值得一提的是，本研究中，仔鱼、稚鱼、幼鱼核心菌群中弧菌属的丰度变化趋势与不动杆菌属的完全相反。可能是二者在仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道中存在某种严格的竞争形成的，也有可能是多种菌群间竞争共同存在导致的。

在水产养殖中，弧菌是弧菌病的重要病原菌，哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)是其中具有代表性的3种弧菌[42-44]。也有研究指出在正常的生物饵料及健康的海水鱼肠道中弧菌也是正常存在的[35,45-47]。同时，本研究中仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道中的优势菌属不动杆菌属，在医学界是备受关注的一类微生物，能够对人类造成致命的伤害[48-49]。目前，已从养殖鱼类中分离鉴定的致病不动杆菌包括鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、洛菲不动杆菌(A.lwoffii)、正约氏不动杆菌(A.johnsonii)、A.pittii等，并且具有一定的耐药性[39,50-51]。可见，苗种繁育阶段，有害菌群就已定殖于健康仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道中，并且丰度较高。如果仔鱼、稚鱼、幼鱼生长过程受到某种因素的胁迫，极易导致肠道菌群失衡，使有害菌群大量繁殖，并且仔鱼、稚鱼、幼鱼自身的免疫机能尚未发育完善，这可能也是育苗过程中病害常发的主要原因之一。

另外，仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道核心菌群中同样也存在着芽孢杆菌、短芽孢杆菌等，这类菌群在水产养殖中被用作益生菌[52-55]。益生菌的存在，与肠道中的病原菌形成各种竞争，直接或间接相互抑制，使肠道菌群处于平衡状态。明确益生菌类群的存在后，可以有针对性的对许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼“土著”益生菌进行分离培养，并对苗种繁育阶段的仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道菌群进行调控，使其维持在理想的动态平衡中，促进苗种的健康培育，这也是笔者今后研究工作的重点。