3种水质调控方式下参池沉积物酶活性的比较研究

魏亚南，张东升，林 青，孙广伟，雷兆霖，张津源，郭 超，陈济丰，周 玮,3

( 1.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连 116023； 2.广州市海大集团，广东 广州 510000； 3.大连市水产产业技术创新联合会，辽宁 大连 116023 )

池塘养殖是辽宁、山东沿海海参的重要养殖方式，随着海参养殖时间的延长，海参病害频发[1]，有效改善海参池塘水质质量、实现高效健康养殖是相关研究的热点问题。自然纳潮[2]是海参养殖中原始的水质调控方式，运行成本低，但沉积物中有机质的分解能力较弱，高温和温跃层时期易造成池塘底部缺氧。微孔曝气[3]是近年流行的一种海参养殖水质调控方式，其方法是在池底铺设微孔增氧管道，提高水体氧化效率。但气孔易堵塞，难于清理，维护成本较高。养水机是本项目团队在实施“十二五”国家支撑计划项目中开发设计的新型水质调控设备，作用方式是将表层水经过生物包再冲入底层水，从而使得表、底层水持续交换，达到净化水质的目的。前期试验显示，养水机调控下的池塘海参成活率可达95%以上[2]，其水质净化效果与海参养殖效果均有明显提高。

土壤中的酶反映了土壤的肥力[4]。施肥、耕种方式、土壤性质都影响土壤中酶的活力，从而影响土壤中氮、磷、钾等元素的可利用性，影响植物生长，因此深受农业学者的重视，而有关养殖池塘中各种酶活性的变化，研究较少。林海[5]的研究表明，增氧池塘沉积物中蛋白酶、脲酶、蔗糖酶等酶活性分别高于自然池塘的3.98%、1.11%、1.25%。前期研究表明，养水机可以有效降低海参池塘沉积物有机质含量[6]，提高异养菌数量[7]，上述结论与沉积物中酶活性的相关性研究，尚未见报道。笔者以自然纳潮池塘、微孔曝气池塘、养水机池塘为对象，对3种调控方式下海参池塘沉积物中淀粉酶、蛋白酶、碱性磷酸酶、脱氢酶的周年活性变化情况进行跟踪比较研究，拟从酶活性角度对3种水质调控方式的机理进行探讨，旨在为海参健康养殖水质调控提供背景资料。

1 材料与方法

1.1 池塘条件

在大连宝发海珍品有限公司分别选择自然海参养殖池塘2口，运行1年的微孔曝气池塘和养水机池塘各2口。池塘规格均为长605 m、宽85 m的标准矩形池塘。池塘均为泥沙底质，铺设网礁，水泥护坡。每月大潮期间换水3～5 d，年水深为1.2～2.0 m。自然池塘未设相关水质调控设施；微孔曝气池塘底部铺设1套微孔曝气系统，由空压机(0.15 W/m2)、总供气管和微孔曝气盘组成，按设备使用规范进行管理操作；养水机池塘在池塘出水口设置养水机1台(功率750 W)，每日21:00至翌日9:00共工作12 h，冬季正常工作。各池塘仿刺参(Apostichopusjaponicus)规格、密度相同，不投饵、不投药，试验期间统一管理。

1.2 样品的采集及处理采样时间及采样点

2015年10月至2016年9月，每月大潮(农历十五)前3～5 d进行采样，冬季时将冰面凿开采样。采样点设在进水口、出水口及池塘中间位置。

间隙水采集：将间隙水采集器向水下垂直插入沉积物至预定深度(-10 cm)，静置等待采集装置内充满间隙水后，将其装入具塞小瓶带回实验室进行分析。

沉积物采集：参照《海洋调查规范》[8]第6部分海洋生物调查中规定的方法进行采集，使用圆柱形采泥器(横截面直径5 cm)采集泥样，取表层0～10 cm沉积物，去除植物根系、贝壳、石块等杂质，装入无菌自封袋中带回实验室后，放在通风良好且避光处风干至恒定质量，将风干后样品进行研磨，用100目筛绢进行过滤、混匀、封袋，4 ℃下保存待测。

1.3 沉积物部分理化因子的检测

按照《海洋调查规范》[8]手册采用YSI Prouplus型水质分析仪测定间隙水温度、pH、溶解氧；沉积物间隙水的总氮测定采用过硫酸钾氧化法；底泥耗氧速率的测定采用实验室测定法[9]；按照《海洋监测规范》[10]中的的重铬酸钾氧化—还原容量法测定沉积物总有机碳、灼烧法测定沉积物有机质含量。

1.4 酶活性的检测

按照文献[11]中方法，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定沉积物中淀粉酶活性，茚三酮比色法测定蛋白酶活性，磷酸苯二钠比色法测定碱性磷酸酶活性，氯化三苯基四氮唑比色法测定脱氢酶活性。

1.5 数据处理

各种酶的试验数据以平均值±标准差表示，各池塘酶和水质之间的相关性采用SPSS 17.0软件进行双变量相关性分析，以皮尔森系数表示相关性的大小，以P<0.05为相关，P<0.01为极相关。

2 结 果

2.1 3种水质调控方式对海参池塘沉积物中淀粉酶活性的影响

各池塘沉积物中淀粉酶活性周年变化见图1。其变化趋势基本一致，自然纳潮、微孔曝气、养水机池塘最高值分别出现在6月、3月、5月，最低值均出现在1—2月。自然纳潮池塘年变化为0.126～0.695 mg/g，极差0.569 mg/g，年均值(0.290±0.169) mg/g；微孔曝气池塘年变化为0.210～0.830 mg/g，极差0.62 mg/g，年均值(0.410±0.199) mg/g；养水机池塘年变化为0.348～0.880 mg/g，极差0.532 mg/g，年均值(0.540±0.171) mg/g。3种水质调控方式相比，养水机池塘沉积物中淀粉酶活性最高，但波动最小，自然池塘淀粉酶活性最低。

图1 3种水质调控方式下池塘沉积物中淀粉酶活性周年变化Fig.1 The annual change in amylase activity in pond sediments under three water quality control methods

2.2 3种水质调控方式对海参池塘沉积物中蛋白酶活性的影响

各池塘沉积物中蛋白酶活性周年变化见图2。其变化趋势基本一致，自然纳潮池塘和微孔曝气池塘最高值均出现在10月，养水机池塘最高值出现在1月，各池塘最低值均出现在7—8月。自然池塘沉积物中蛋白酶活性年变化为0.063～0.472 mg/g，极差0.409 mg/g，年均值(0.230±0.084) mg/g；微孔曝气池塘年变化为0.044～0.354 mg/g，极差0.310 mg/g，年均值(0.190±0.101) mg/g；养水机池塘年变化为0.024～0.294 mg/g，极差0.270 mg/g，年均值(0.16±0.125) mg/g。3种水质调控方式相比，养水机池塘沉积物中蛋白酶活性最低，波动最小，自然池塘活性最高，波动最大。

图2 3种水质调控方式下池塘沉积物中蛋白酶活性周年变化Fig.2 The annual change in protease activity in pond sediments under three water quality control methods

2.3 3种水质调控方式对海参池塘沉积物中碱性磷酸酶活性的影响

各池塘沉积物中碱性磷酸酶活性周年变化见图3。其周年变化趋势基本一致，最高值均出现在8月，最低值自然纳潮池塘在3月，微孔曝气和养水机池塘均在10月。自然池塘沉积物中碱性磷酸酶活性年变化为0.165～1.042 mg/g，极差0.877 mg/g，年均值(0.47±0.243) mg/g；微孔曝气池塘年变化为0.068～0.726 mg/g，极差0.658 mg/g，年均值(0.32±0.193) mg/g；养水机池塘年变化为0.083～0.633 mg/g，极差0.550 mg/g，年均值(0.24±0.152) mg/g。3种水质调控方式相比，养水机池塘沉积物碱性磷酸酶活性最低，波动最小，自然池塘年均值最高，波动最大。

图3 3种水质调控方式下池塘沉积物中碱性磷酸酶活性周年变化Fig.3 The annual change in alkaline phosphatase activity in pond sediments under three water quality control methods

2.4 3种水质调控方式对海参池塘沉积物中脱氢酶活性的影响

各池塘沉积物中脱氢酶活性周年变化见图4。其变化趋势不一致，自然纳潮池塘最高值出现在11月，最低值出现在8月，年变化为19.681～52.794 mL/g，极差33.113 mL/g，年均值(34.78±10.010) mL/g；微孔曝气池塘最高值出现在6月，最低值出现在10月，年变化为12.200～31.638 mL/g，极差19.438 mL/g，年均值(19.88±6.184) mL/g；养水机池塘最高值出现在1月，最低值出现在7月，年变化为12.092～41.411 mL/g，极差29.319 mL/g，年均值(26.28±8.69) mL/g。3种水质调控方式相比，微孔曝气池塘沉积物脱氢酶活性最低，波动最小，与养水机池塘酶活性差异不显著，自然池塘活性最高，波动性也最大，与微孔曝气、养水机池塘差异性显著(P<0.05)。

图4 3种水质调控方式下池塘沉积物中脱氢酶活性周年变化Fig.4 The annual change in dehydrogenase activity in pond sediments under three water quality control methods

2.5 3种水质调控方式下沉积物部分理化指标情况

3种水质调控方式下沉积物部分理化指标见表1。自然纳潮池塘、微孔曝气池塘及养水机池塘间隙水温度年变化分别为-2.1～27.5 ℃、-2.0～27.1 ℃、-2.0～27.5 ℃，各池塘差异不显著；间隙水pH年变化分别为7.3～8.5、7.4～8.5、7.4～8.6，各池塘差异不显著；间隙水总氮年变化分别为23.930～48.140 mg/L、26.540～49.960 mg/L、28.730～40.540 mg/L，各池塘差异不显著；沉积物总有机碳年变化分别为83.270～249.680 mg/L、77.690～408.510 mg/L、53.970～375.170 mg/L，各池塘差异不显著；沉积物有机质年变化为1.020%～1.430%、0.930%～1.230%、0.750%～1.030%，各池塘之间差异均极显著(P<0.01)；沉积物底泥耗氧率年变化为711～996 mg/(m2·d)、666～731 mg/(m2·d)、633～726 mg/(m2·d)，自然纳潮池塘与微孔曝气池塘、养水机池塘差异均极显著(P<0.01)，微孔曝气池塘与养水机池塘差异不显著。

表1 3种水质调控方式下沉积物部分理化指标Tab.1 Some of physicochemical indices of sediments under three water quality control methods

综上所述，沉积物有机质、蛋白酶、耗氧率、碱性磷酸酶及脱氢酶活性均在自然池塘中均值最高，变化幅度最大，淀粉酶活性则最低；而间隙水温度、pH、总氮、总有机碳均在微孔曝气池塘中均值最高。

2.6 3种水质调控方式池塘沉积物酶活性与间隙水理化因子相关性

各池塘沉积物酶活性与间隙水理化因子相关性见表2。各池塘淀粉酶均与pH呈正相关；蛋白酶均与总氮呈正相关，与有机质、pH、底泥耗氧率呈极负相关，与温度呈负相关，在微孔曝气池塘与养水机池塘中蛋白酶活性分别与碱性磷酸酶活性呈极负相关、负相关；碱性磷酸酶与总有机碳、温度呈正相关；脱氢酶活性在自然纳潮池塘与养水机池塘中与总氮呈正相关。

表2 3种水质调控方式各池塘沉积物酶活性与间隙水理化因子的相关性Tab.2 Correlation between sediment enzyme activity and interstitial water physicochemical factors in three water quality control methods

注：*在0.05级别，相关性显著；**在0.01级别，相关性极显著.

Note: * denotes that the correlation is significant at the level of 0.05;** denotes that the correlation is very significant at the level of 0.01.

3 讨 论

池塘沉积物酶是构成沉积物的重要组成之一，数量少，作用大，产生于沉积物中的微生物、动物和植物根系生命活动的积累过程[12-15]。沉积物酶作为沉积物中一切生物化学反应的主要参与者，在沉积物生态系统的物质循环和能量转化中起着非常重要的作用，反映了沉积物中各种生物化学过程的强度和方向，其活性大小代表了沉积物中物质代谢的旺盛程度[16]。

3.1 3种调控方式下各池塘沉积物酶活性周年变化分析

3.1.1 沉积物脱氢酶活性变化原因分析

在沉积物所含的所有酶中，脱氢酶反映了微生物代谢强度的大小，可以作为微生物氧化还原系统的指标，被认为能很好地表征沉积物中微生物的氧化能力[17]，与沉积物呼吸呈正相关，而与微生物量无关[17-18]。本研究测定的自然纳潮池塘底泥耗氧量和脱氢酶含量最高，而同期测定的自然纳潮池塘沉积物中可培养异养菌数量[7]最低，这样的结果与文献一致，这可能与采样时间有关。采样时自然纳潮池塘与其他两类池塘相比，有机质含量最高，导致其微生物活性仍处于较高的水平，从侧面反映了自然纳潮池塘在换水前仍有大量可被微生物利用的有机质存在，说明自然纳潮池塘仅通过交换水不能有效地清除过多累积的有机物；而养水机和微孔曝气池塘脱氢酶活性采样时较低，说明池塘中可被微生物利用的有机质较少[6]，这样可被细菌利用的有机质不会过多积累于池塘底部，在夏季高温期，就不会大量消耗氧气，产生有害化合物，而使池塘底部溶氧较高、水质较好，有利于海参健康生长，特别是养水机池塘。

3.1.2 沉积物蛋白酶、碱性磷酸酶活性变化原因分析

蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，提供生物可利用氮，与土壤总氮呈正相关[19-21]，碱性磷酸酶能加速有机磷的脱磷速度[22]，与土壤中总磷呈正相关[4,20,23]，本研究测定的养水机池塘沉积物中蛋白酶含量和碱性磷酸酶含量与脱氢酶含量一样，均最低，说明此时养水机池塘有机氮和有机磷的剩余量较少[6]，即养水机能够快速去除池塘沉积物中的有机氮和有机磷，避免池塘沉积物有机氮和有机磷的积累，避免夏季高温期厌氧发酵，毒害海参。

3.1.3 沉积物淀粉酶活性变化原因分析

淀粉酶是参与碳循环的重要酶类[24]，碳源分解一方面为细菌的生长提供碳源，另一方面为微生物生长提供能源。本研究养水机池塘淀粉酶活性最大，说明养水机池塘沉积物有机碳分解强度较大。这与每月采样时间有关，每月采样时间均为池塘纳水半个月后，此时供细菌生长的有机氮、有机磷已很少，养水机池塘较其他两种水质调控方式池塘产生大量细菌及真菌[7,25]，为供其生存，需消耗淀粉获得能量，导致养水机池塘淀粉酶活性最高。

本试验从酶的角度探究了3种水质调控方式下，池塘沉积物中酶的活性变化情况，研究可知养水机池塘由于打破上下层水体交换，使上层水中的溶氧输入下层水，使沉积物中有机质输入上层水中，加快了有机质的降解效率，致使进水一段时间后，蛋白酶和碱性磷酸酶活性降低，在本试验条件下，养水机比自然池塘和微孔曝气池塘更加快速的降解了含氮、含磷有机质，目前养水机的使用功率比微孔曝气在去除有机质方面更加有效，但这种功率是否为最佳，有待于进一步研究。

3.2 池塘沉积物酶活性与其他环境因子的关系

沉积物酶活性与沉积物的理化因子、生物因子密切相关，本研究测定的3种水质调控方式池塘沉积物中淀粉酶、蛋白酶、碱性磷酸酶及脱氢酶含量均不同，可能与3种水质调控方式下沉积物中微生物组成不同有关[26]。

值得注意的是,养水机池塘脱氢酶活性与蛋白酶活性呈正相关，说明养水机池塘决定微生物活性强度的是氮，而微孔曝气池塘决定微生物活性的却是磷，因此，为加强养水机池塘微生物活性，是否可在水中加有机氮，有待于进一步研究。

一般在底物含量充足及其他环境适合的条件下，在一定温度范围内，酶活性随温度的升高而升高，本研究淀粉酶、碱性磷酸酶与此情况相一致(表2)，而蛋白酶却具有随温度升高而呈下降的趋势，这可能是因为蛋白酶底物是有机氮，而各池塘有机氮含量随温度升高而下降，因此蛋白酶呈现出夏季低冬季高的特点。自然纳潮池塘的脱氢酶活性在温度较低的11月和3月较高，而养水机池塘脱氢酶活性在温度最低的1月较高，而不是在温度较高的7—8月较高，这两类池塘的脱氢酶活性均与池塘总氮呈正相关，而微孔曝气池塘脱氢酶活性却在温度较高的6、8月较高，这种现象值得进一步试验，以了解这些酶发生变化的机制。此外，养水机和微孔曝气池塘中脱氢酶活性在3、10、11月，碱性磷酸酶活性在5、8、10、11月，蛋白酶活性在5、6、11月均显著低于自然纳潮池塘，虽然周年沉积物酶活性与水中的氨氮、亚硝态氮含量相关性不显著，但在上述时间段沉积物中酶的含量与水中的氨氮、亚硝态氮含量一致[27]，养水机池塘中酶活性、氨氮、亚硝态氮含量最低，自然纳潮池塘中最高，这段时间正是海参复苏，大量进食阶段，养水机池塘氨氮和亚硝态氮低含量均有利于海参的生长。