藏药波棱瓜子壳中总甾醇的同时检测及分离鉴定

李韵之　刘文亚　陈怀玲　宋谕　汪俊松

【摘 要】目的：采用HPLC法同时检测波棱瓜子壳中的总甾醇，并对其中两个含量较大的甾醇进行分离鉴定。方法：采用Thermo Acclaim 120 C18 色谱柱（25cm*4.6mm，5μm）;流动相为100%甲醇;柱温为35℃;流速为 1.5 mL·min-1 ;检测波长205nm;进样量10μL。采用硅胶柱层析、结晶、制备薄层以及NMR等色谱和光谱手段对其中两个含量较高的甾醇进行了分离鉴定。结果：波棱瓜子壳中的总甾醇在建立的色谱条件下分离良好，两个含量较大的甾醇分别鉴定为7，22，25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇。结论：首次建立了波棱瓜子壳中同时检测总甾醇的方法，此方法操作简便，重复性好;甾醇结构的确定为波棱瓜子的综合利用提供了依据。

【关键词】高效液相色谱法（HPLC）;波棱瓜子壳;总甾醇;豆甾三烯醇;菠甾醇

【中图分类号】R657.72 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2020）03-09--01

波棱瓜子（Herpetospermum caudigerum Wall.）是葫蘆科植物波棱瓜成熟干燥的种子，藏语为“色吉美多”，是传统藏医药，在藏族医学中有着广泛的用途。多用来与其他藏药配伍，治疗多种肝胆疾病。本课题组对波棱瓜子壳未进行皂化，而是进行了富集纯化，得到了纯化后的总甾醇。然后利用RP-HPLC法首次对纯化的波棱瓜子壳总甾醇进行了同时检测，方法简单易操作，重复性良好，分离度高。并对其中两个含量较大的甾醇进行了分离、鉴定，两者均首次从波棱瓜子壳中分离得到。甾醇测定方法的建立以及结构的确定为波棱瓜子药效物质基础的阐明、综合开发利用提供了理论基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

高效液相色谱仪CTO-20A（日本岛津）;THERMO SCITIFIC UltiMate3000超高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技）;YMC-Pack ODS-A色谱柱（20*250mm，日本YMC）;电子天平 AR224CN （奥豪斯仪器）;旋转蒸发仪 OSB-2000 （惠恒科技）;硅胶柱（青岛海洋化工）;HPLC用甲醇为色谱级，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等其余试剂均为分析级。

试药为波棱瓜子壳总甾醇（Total Sterols In the Shell of Herpetospermum caudigerum Wall.， 缩写为HCSTS），为实验室自制。其中波棱瓜子壳采自于西藏林芝地区。

1.2 方法与结果

1.2.1 HCSTS的制备

波棱瓜子壳7.4 Kg粉碎至30目，用10倍量乙醇回流提取3次，减压回收溶剂得浸膏350 g。适量水混悬后，用石油醚萃取3次，减压回收溶剂得石油醚部位90 g。取石油醚部位30g，适量硅胶拌样，于硅胶柱上用石油醚：乙酸乙酯（9：1-7：3）梯度洗脱，Liebermann-Burchard反应检测，合并甾醇流分，回收溶剂，得甾醇粗品约1.2 g。甾醇粗品用二氯甲烷与甲醇混合溶剂溶解，放置析晶，晶体用无水乙醇重结晶得总甾醇纯品（HCSTS）540 mg。

1.2.1 色谱条件之流动相的考察

精密称取5 mg HCSTS，用THF溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤，制成1 mg/mL的供试品溶液。初试乙腈-水、100%乙腈系统，无论是等度还是梯度，洗脱效果均不理想，故采用甲醇-水系统作为流动相。分别考察了97%、98%以及100%甲醇三个洗脱比例。色谱柱：Thermo Acclaim 120 C18 色谱柱（25cm*4.6mm，5μm）;柱温为30℃;流速为 1 mL·min-1 ;检测波长205nm;进样量10μL。结果显示，100%甲醇在15.3-22.5min内将甾醇全部洗脱出来，且各峰之间分离度较好，而97%和98%甲醇分别在20.1和17.4min才将第一个峰洗脱出来，且分离度较差。因此，选择100%甲醇作为流动相洗脱HCSTS。

1.2.2 色谱条件之温度的考察

供试品溶液配制同1.2.1，流动相为100%甲醇，温度设为35、45、55三个梯度。其余色谱条件1.2.1。结果显示，升高温度后，第一峰的出峰时间逐渐缩短，表明甲醇对HCSTS的洗脱能力增强，但同时伴随着分离度的逐渐降低，综合考虑，选择35℃作为洗脱温度。

1.2.3 色谱条件之流速的考察

供试品溶液配制同1.2.1，流动相为100%甲醇，温度为35℃，流速设为1、1.5、2 ml/min 三个梯度。其余色谱条件1.2.1。结果显示，流速为1.5 ml/min的时候，第一峰出峰时间约为10 min，全部洗脱约15 min，而1 ml/min的时候全部洗脱需要23min，并且与1.5 ml/min相比，两者分离度相差不大，而流速为2 ml/min时，虽洗脱时间大为减少，分离度也较好，但甾醇第一峰与前面的杂质可能会有重合，且考虑到柱子及仪器的使用安全，故综合考虑，流速设为1.5ml/min。

1.2.4 色谱条件与专属性考察

经过前面对流动相、温度以及流速分别进行考察后，确定为合适的洗脱条件为：采用Thermo Acclaim 120 C18 色谱柱（25 cm*4.6 mm，5 μm）;流动相为100%甲醇;柱温为35℃;流速为 1.5 mL·min-1 ;检测波长205 nm;进样量10 μL。记录色谱图20 min。

在该色谱条件下，两个量大的甾醇a和e峰型好，且与其他几个含量较低的甾醇达到了理想的分离效果。b、c、d、f几个甾醇对a和e的分析和分离均无干扰。

1.2.5 精密度与稳定性考察

精密吸取HCSTS溶液10 μL，按“1.2.4”的色谱条件重复进样6次（n=6），记录a和e的峰面积，计算得a和e的峰面积RSD分别为1.12%和1.07%，表明该方法的精密度良好。取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h进样，记录峰面积，计算得a和e的峰面积RSD分别为0.86%和1.02%，表明HCSTS溶液在24 h内稳定。

1.2.6 重复性考察

按“1.2.1”项配置6份HCSTS溶液，并按“1.2.4”项的色谱条件测定，记录峰面积。计算得甾醇a和e的峰面积RSD分别为1.75%和1.12%，表明该方法的重复性良好。

1.2.7 a和e的分离与鉴定

由图1可知，a和e为含量较大的两个甾醇，且分离度较好，易于制备分离。取100 mg HCSTS，适量THF溶解，制备分离得到化合物单体a（29 mg）和e（45 mg）。a和e均为白色针状结晶，L-B反应阳性，TLC上展开剂比例为石油醚-乙酸乙酯（7：3）时，Rf约0.5，10%硫酸-乙醇显紫红色。在ACPI-MS质谱中，a和e的加合离子[M+H-H2O]+分别为392.2443和394.3559，因此，给出a和e的分子量分别为410.3549和412.3705。经核磁共振1H-NMR和13C-NMR鉴定，确定了甾醇a为7，22，25-豆甾三烯醇，e为α-菠甾醇。

2 討论

植物甾醇极性小、结构相似，极性相差不大，且紫外无吸收，常常在石油醚部位与油脂共存，分析、分离较为困难。本课题组前期对样品直接分析，发现杂质较多，峰型很差，可能是由于非极性及小极性物质影响较大。文献中对甾醇的分析多是先提取，再皂化，然后萃取，之后就进行HPLC分析，不可避免会有其他物质的干扰甾醇分析。本课题组首先对石油醚部位的甾醇进行富集，除去了大部分油脂、色谱和其他类物质。又利用混合溶剂对甾醇粗品进行结晶和重结晶，得到了含有多种甾醇的总甾醇，而几乎不含其它类的杂质，大大提高了分析的准确度和可信度。对总甾醇的分析，前期尝试了乙腈-水、100%乙腈系统，发现乙腈系统相比于甲醇系统对总甾醇的洗脱能力较弱，可能是由于乙腈极性较大，甾醇样品在乙腈中溶解度较低的缘故，故本实验选用甲醇系统作为流动相。由于甾醇类物质的紫外吸收波长很短，又考虑到基线平稳，选择205nm作为检测波长。本课题组分别考察了温度、流速、流动相等因素，确定了色谱条件如“1.2.4”。此方法具有分析时间短、峰型好、杂质干扰小、分离度高的特点。对其中的两个含量较高的甾醇a和e进行了制备纯化，并确定了其结构。大量文献报道，植物甾醇具有显著的降低血脂、胆固醇的功效，而2型糖尿病患者普遍存在血液中低密度脂蛋白和甘油三酯浓度偏高等血脂异常症状，纯化的总甾醇或许会为糖尿病的治疗与控制提供新思路。色谱方法的开发和甾醇结构的确定对于后期波棱瓜子壳中甾醇含量测定乃至其他植物甾醇的分析，都会有一定的参考价值。

参考文献：

宇妥， 元丹贡布. 四部医典精版[M]. 江苏科学技术出版社， 2016.

李崇忠. 藏族民间治胃病验方三则[J]. 医学文选， 1991，（4）： 5-6.