不良IVF结局患者NK细胞信号通路调节FoxP3细胞表达的研究

梁雨，曾彬，于婉莹，李翠

(唐山市妇幼保健院生殖医学中心，唐山 063000)

不孕不育症是继恶性肿瘤、心血管疾病之后第三大危害人类健康的疾病。资料显示，全世界范围内约15%的已婚夫妇受到生殖健康问题的困扰，而我国已婚夫妇中不能生育率占比约为12.5%[1-2]。体外受精(IVF)是辅助生殖技术的核心部分，亦是近代医学进程中治疗不孕症的最重要方式之一。但该种方式治疗现状并不乐观，据欧洲IVF检测协会(EIM)公布的数据显示，IVF周期妊娠率低于20%[3]。绝大多数接受治疗的患者需要承受反复受精失败、生化妊娠等不良结局，不仅对其造成巨大的经济压力还会影响身心健康。目前，人们致力于研究IVF不良结局致病原因，期望通过早期干预来防治不良结局的发生。有研究表明，孕妇外周血液中NK细胞、调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)细胞数目和功能上调能够帮助维持妊娠活动的正常进展[4]。而最新的观点表示，NK细胞数目和功能变化不仅与辅助生殖技术不良治疗结局相关，还会参与到生殖失败的发病机制。资料显示，随着外周血NK细胞数目和活性的增加IVF周期胚胎植入率明显下降，而Treg细胞特征标志物叉头样转录因子P3(forkhead box P3，FoxP3)表达也显著减少[5]。基于此，本研究分析外周血中NK细胞通路调节Foxp3表达对IVF的影响，为IVF不良结局预防和治疗提供指导。

资料与方法

一、研究对象

选取我院自2018年1月至2019年1月间收治的75例IVF不良结局患者。

纳入/排除标准：婚后同居时间≥1年，行IVF失败者；对研究知情且自愿参与临床研究者，经医院伦理委员会批准实施；排除合并染色体核型异常、多囊卵巢综合征、性激素异常和抗心磷脂综合征等自身免疫系统疾病者。

依据IVF失败类型分成3组：实施IVF≥3次均未获得妊娠者(反复失败组，25例)；实施IVF后仅生化妊娠患者(生化妊娠组，25例)；实施IVF后妊娠12周内胚胎停止发育/自然流产者(流产胚停组，25例)。选取同期生育1次的健康未孕女性25例作为对照组。

二、研究方法

1.试剂与仪器：人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品公司；CD3-APC、CD4-PerCP、CD16-FITC、CD25-FITC、CD56-PE流式抗体和CFSE细胞膜染料均购自美国eBioscience公司；人CD4+CD25+Treg分选试剂盒、T细胞活化/扩增试剂盒以及人NK细胞磁珠分选试剂盒购自美国Miltenyi Biotec公司；牛血清白蛋白、胎牛血清(FBS)和RPMI1640均购自美国Gibco公司；无菌EDTA抗凝采血管、96孔培养板均购自美国BD公司；磷酸盐缓冲液购自美国SAB公司；EasySep Direct Human Totallymphocyte kit 购自美国Stemcell公司。

变温冰箱购自韩国SAMSUNG公司，BX51型正立式显微镜购自日本Olympus公司；分析天平购自瑞士Mettler Toledo公司，低速离心机购自美国Thermos公司，流式细胞检测仪购自美国BD公司。

2.样本采集：负压针采集IVF不良结局患者、对照组受检者外周静脉血样3 ml，注入6 ml无菌EDTA抗凝管中颠倒2～3次。离心机预冷至20℃，配置染色缓冲液、破膜/固定液等，置于4℃冰箱待用。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)[6]。

3.测定方法：采用免疫磁珠分选法从PBMC中分离NK细胞、CD4+CD25-Treg细胞。

NK细胞分选、扩增培养及活性检测：依据人NK细胞分选试剂盒说明获得纯化的NK细胞。染色计数后采用流式细胞术测定纯度。取4支试管，依据表1的方式加入流式抗体和NK细胞悬液，注意不要碰到管壁，涡旋混匀后室温避光保存20 min。使用三色流式细胞检测仪测定外周血NK细胞亚群(图1)，用Cell quest软件分析换算CD3-、CD56+CD16-和CD56+CD16+细胞比例。

表1 流式抗体和NK细胞悬液加入方式

A：CD3-细胞群分布在P2门内；B：CD56+CD16+分布于Q2象限，CD56+CD16-分布于Q1象限，Q1、Q2象限之和为CD56+图1 流式细胞检测仪测定外周血NK细胞亚群

FoxP3 mRNA表达测定：将CD4+CD25-Treg细胞与TNF-α活化的NK细胞共培养，采用抗CD3/CD28微珠刺激培养3 d。采用实时定量PCR(qPCR)技术以Trizol提取总RNA逆转录合成cDNA，然后进行PCR扩增。(1)引物：目的基因FoxP3引物序列：上游5’-GAGAAGGAGAAGCTGAGTGCCAT-3’，下游5’-AGCAGGAGCCCTTGTCGGAT-3’，扩增片段154 bp[6]。内参基因β-actin引物：上游5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，下游5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’，扩增片段长度为205 bp。(2)反应条件：95℃ 5 min；95℃ 40 s、58℃ 40 s、72℃ 40 s，22个循环；最后72℃ 7 min。(3)扩增产物：qPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中拍照。(4)荧光定量检测：使用图像分析软件分析各条带平均灰度值，β-actin为内参照，用FoxP3/β-actin的CT比值表示。

NK细胞对FoxP3表达的调节：将免疫磁珠分离纯化的CD4+CD25-Treg细胞以每孔1×105个加入到96孔板中，均饥饿24 h后同步化，按照不同处理进行分组：M0组(空白组)加3%FBS培养液培养，M1组加含20 ng/ml的TNF-α，M2组加TNF-α活化的NK细胞，培养3 d，流式检测FoxP3的表达情况。

三、统计学方法

结 果

一、患者一般资料比较

3组IVF不良结局患者及对照组间年龄、月经周期比较均无统计学差异(P>0.05)；3组IVF不良结局患者间不育原因构成比较亦无统计学差异(P>0.05)(表2)。

二、各组受检者外周血NK细胞各亚群水平差异

与对照组比较，3组IVF不良结局患者CD56+CD16-NK细胞水平略下降，但4组间比较无统计学差异(P>0.05)。相较于对照组，3组IVF不良结局患者CD56+NK细胞、CD56+CD16+NK细胞水平均显著升高(P<0.05)；3组IVF不良结局患者中流产胚停组CD56+NK细胞水平显著高于其他两组(P<0.05)(表3)。

表2 各组患者一般资料比较[(±s)，n(%)]

表3 4组受检者NK亚群活性百分比(%)比较 (±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与其他各组比较，#P<0.05

三、各组受检者中CD4+CD25-Treg细胞中FoxP3 mRNA的表达情况

qPCR检测结果显示，3组IVF不良结局患者CD4+CD25-Treg细胞的FoxP3 mRNA表达量存在明显差异，流产胚停组显著高于其他两组(P<0.05)。反复失败组和生化妊娠组Treg细胞中FoxP3 mRNA表达量最低，流产胚停组次之，与健康对照组比较均有统计学意义(P<0.05)(图2)。

与对照组比较，*P<0.05；与流产胚停组比较，#P<0.05图2 qPCR检测4组间Treg细胞中FoxP3 mRNA表达情况

四、TNF-α诱导NK细胞影响CD4+CD25-Treg细胞中FoxP3表达

取流产胚停组CD4+CD25-Treg细胞，添加TNF-α培养3 d后(M1组)，FoxP3表达略降低，但与M0组差异无统计学意义(P>0.05)；而CD4+CD25-Treg细胞与TNF-α活化的NK细胞共培养3 d后(M2组)，FoxP3表达显著下降，显著低于M0组(P<0.05)(图3)。分析NK细胞与CD4+CD25-Treg细胞中FoxP3表达的关系，显示两种细胞呈负相关，相关系数r=-0.51(P<0.05)。

M0：空白组；M1：TNF-α组；M2：TNF-α活化NK细胞组图3 TNF-α诱导的NK细胞对FoxP3表达的影响

讨 论

NK细胞是一群具有独特杀伤、免疫调节功能的大颗粒淋巴细胞，健康人的外周血中含量仅为淋巴细胞的5%～10%间。在以往的研究中，人们发现NK细胞所介导的天然免疫应答在宿主抵抗病原菌感染、恶性肿瘤中发挥了巨大的作用[7]。近年来，人们发现外周血NK细胞数目增加或毒性表型活性升高，Treg细胞数目下降或功能下调与原发性不孕、习惯性流产等密切相关[8-9]，该两种细胞数目和功能对IVF结局的预测价值已得到证实，而作为Treg特征性标记物的FoxP3的表达也直接关系IVF的结局。本研究分析IVF不良结局是否与NK细胞调节FoxP3的表达有关，为改善IVF结局提供一定参考。

研究中将IVF不良结局患者依据失败类型分成3组，并且与已育健康女性进行对比分析，结果显示病例组患者NK细胞中CD56+、CD56+CD16+活性均显著高于健康对照组，但3组间CD56+CD16+数目无明显差异，而流产胚停组CD56+活性显著高于其他两组，可能与检测操作不当形成误差有关，亦或者存在某种内在联系需要进一步验证；与此同时，4组受检者细胞分泌型CD56+CD16-NK细胞数目无显著差异，与路岳超[10]的研究结果大致吻合，提示IVF不良结局仅与CD56+、CD56+CD16+NK细胞数目增多有关。NK细胞中CD56+CD16+细胞亚群约占NK细胞亚群的90%以上，其可通过非特异性溶细胞、抗体Fc段结合介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)，起到杀灭细胞的作用，因此也被称之为NK细胞毒性表型；而起免疫调节作用的CD56+CD16-NK细胞占比约为10%[11-12]。外周血NK毒性表型上调导致IVF不良结局的机制可能有以下几点：首先，NK毒性表型细胞上调会影响子宫内NK细胞活性变化，而子宫内NK细胞均由外周血分化而来，子宫内NK细胞增殖会在母胎界面分泌硫酸软骨素蛋白聚糖、穿孔素等分子继而发挥非特异性溶胚胎细胞作用，导致胚胎细胞损伤引发流产[13]；其次，外周血NK毒性表型细胞数目增加会促使NK细胞毒性增强，继而影响循环系统的免疫耐受，导致着床失败。

qPCR检测结果显示不同类型IVF不良结局患者中FoxP3 mRNA表达存在明显差异，推测FoxP3参与到了IVF的整个活动中，且对IVF可能起到保护作用。本研究的不足是未开展免疫组化实验进一步证实FoxP3在血液细胞中的表达情况，而相关研究显示，癌症细胞中内源性FoxP3多表达于细胞核中，激光共聚焦结果显示多表达于细胞浆中，主要因为肿瘤组织、细胞微环境差异所致，推测在IVF不良结局中FoxP3表达的不同也对其微环境起到调节作用[14]。

以往的研究和本实验结果，均提示外周血NK细胞毒性表型、Treg细胞功能表型都参与了IVF不良结局的过程。有资料显示，CD56+CD16+NK细胞活性>12%、CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞<2%对IVF不良结局有预测价值[15]。NK细胞可表达免疫激活型、抑制型受体，并通过这些受体行使其生理功能[16-17]。若相应配体和激活型受体发生结合，NK细胞活化后会分泌大量的效应分子以发挥其作用。本研究结果显示，经TNF-α活化的NK细胞刺激CD4+CD25-Treg细胞后，FoxP3表达量显著低于空白组(M0组)，虽然经单纯TNF-α刺激后FoxP3表达也有下降，但差异无显著性，提示活化的CD56+CD16+NK对FoxP3表达有抑制下调作用，从而导致Treg细胞数目和活性下降。

综上所述，NK细胞可通过抑制Treg细胞中FoxP3的表达来产生非特异性溶胚胎细胞作用，且可通过抗体Fc段结合产生ADCC效应损伤胚胎细胞，影响正常的妊娠活动，导致反复受精失败、生化妊娠以及流产胚胎停育等不良妊娠结局发生。