蟾毒灵通过基质金属蛋白酶抑制人结肠癌细胞HCT116的侵袭和迁移*

董倩倩，张俊萍

(1.周口市中心医院肛肠外科，河南 周口 466000； 2.河南省中医药研究院附属医院肿瘤科，河南 郑州 450004)

在全球范围内，结直肠癌是第三大恶性肿瘤，并且在肿瘤相关性死亡率中居第四位。预计在2030年，结直肠癌的发生率将会增长60%[1]。目前，遗传学与转录组学的相关研究进展极大地促进了结直肠癌的诊断与治疗，但是晚期结肠癌对大多数联合治疗措施往往会形成肿瘤耐药，最终转移是结肠癌相关性死亡的主要原因[2]，因此，防止结肠癌的发生发展、侵袭转移，并且有效延长结肠癌患者的生存期就显得尤为关键。近来，由于基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)具有显著的抗肿瘤侵袭转移的作用，越来越多的科研工作者开始关注和探索其抗肿瘤机制，并且以此开发相应的抗肿瘤药物[3]。中国传统中药蟾酥(Bufonis Venenum)为中华大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)的耳后腺体分泌的白色浆液，经干燥加工制得[4]。目前认为，蟾毒灵是蟾酥抗肿瘤作用的主要活性单体，对多种实体瘤包括胃癌、肝癌、食管癌、肺癌，以及白血病等具有治疗作用[5-9]。蟾毒灵是否能够通过影响基质金属蛋白酶-2(MMP-2)与基质金属蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)的相互作用关系从而抑制结肠癌的侵袭和转移，国内外鲜见报道。本实验旨在研究蟾毒灵通过调控MMP-2 和TIMP-2抑制人结肠癌细胞HCT116侵袭和迁移的作用机制，为蟾毒灵抗消化道肿瘤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 人结肠癌细胞HCT116

HCT116购自中国科学院上海细胞库，用含有体积分数100 mL/L 胎牛血清的RPMI1640培养基，在37 ℃、体积分数为50 mL/L的CO2培养箱中传代培养，当细胞汇合度达到80%时消化细胞进行传代及后续实验。

1.2 药品、试剂与仪器

蟾毒灵标准品购自北京索莱宝科技有限公司，批号7023021，使用前用1 mmol/L二甲基亚砜(DMSO)溶解，得到50 mmol/L的母液，实验给药时用含20 mL/L 血清的RPMI1640培养基稀释至所需浓度。顺铂(DDP)注射液，江苏豪森药业集团有限公司产品，批号080602；RPMI 1640细胞培养基，美国Hyclone公司产品，批号SH30809.1；胎牛血清，美国Gibco 公司产品，批号10099-141；胰蛋白酶，中国碧云天公司产品，批号041819190617；人工重构基底膜胶，美国Corning公司产品，批号8204010；Transwell小室，美国Corning公司产品，批号302140003；CCK-8检测试剂，美国Vazyme公司产品，批号A311-02-AA；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，中国碧云天公司产品，批号P0009-1；SYBR PremixEx TaqTMⅡ，美国Takara公司产品，批号AIF2352A；MMP-2，美国Cell Signaling Techology公司产品，批号40994S；TIMP-2，美国Cell Signaling Techology公司产品，批号5738S；β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体，美国Cell Signaling Techology公司产品，批号4970S；超敏ECL化学发光试剂盒，美国Thermo公司产品，批号UD281582； HRP 标记的羊抗兔 Ig G二抗，美国thermo公司产品，批号G-21234。蛋白电泳槽、转膜仪、ChemiDoc XRS+凝胶成像分析仪，美国 Bio-Rad 公司产品；多功能酶标板分析仪，美国PerkinElmer公司产品；Heracell-150型CO2培养箱、MSC1.2型生物安全柜，美国Thermo公司产品；IX73型倒置荧光显微镜，日本 Olympus 公司产品；Lightcycler 96型荧光定量PCR 仪，瑞士Roche 公司产品。

1.3 检测指标

1.3.1 HCT116增殖能力

采用CCK-8实验方法检测。取对数生长期的HCT116用胰酶消化，制成单细胞悬液(5×104个/mL)，均匀接种于96 孔培养板中，每孔100 μL，培养24 h，待细胞贴壁后，每孔加入200 μL RPMI-1640 培养液(空白组)或含蟾毒灵培养液(0.125,0.25,0.5,1,2 μmol/L)，并设野生型细胞对照组，每组5个复孔。继续孵育培养24，48，72 h后，加入CCK-8试剂 20 μL反应2 h，酶标仪上在波长450 nm 处测定每孔吸光度 (optical density,OD)值，取复孔平均OD值进行统计，按以下公式计算细胞增殖率。细胞增殖率=药物组OD值/对照组OD值。

1.3.2 HCT116侵袭和迁移能力

采用Transwell检测。取人工基底膜Matrigel胶，按Matrigel∶空培养基=1∶8的比例制备成无血清基底膜胶混合物，均匀覆盖于Transwell 小室的上室内，每孔50 μL，放于37 ℃细胞培养箱内，2 h后凝固待用(迁移实验不提前包被Matrigel胶)。按对照组、蟾毒灵(0.25,0.5, 1 μmol/L)组和顺铂组(2 mg/L)取1×105个对数期生长的HCT116稀释至200 μL无血清RPMI 1640培养基中，置于上室，下室加入含体积分数为100 mL/L 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基500 μL。每一组细胞均设5个复孔。培养24 h，取出Transwell小室并用提前预冷的磷酸盐缓冲液(PBS) 轻轻冲洗2遍，用棉签轻轻擦去上室表面的细胞。滤膜在质量分数为40 g/L 多聚甲醛溶液中固定20 min，在室温下用质量分数为1 g/L的结晶紫染液染色15 min，PBS清洗3遍，自然风干，于光学显微镜下计数穿膜细胞数量。随机选取5个视野，计算平均值。

1.3.3 MMP-2和TIMP-2的蛋白表达水平

采用Western blot检测。取对数期HCT116经胰酶消化后接种于6孔板中，细胞贴壁后(24 h)按对照组、蟾毒灵(0.25，0.5，1 μmol/L)组和顺铂组(2 mg/L)加入药物，继续培养24 h后，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min, 4 ℃ 离心20 min,提取细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定后制备样品。接着进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件为70V 恒压 60 min，120 V恒压电泳20 min；将胶上分离的蛋白转移至PVDF 膜上，转膜条件为300 mA恒流90 min；用TBST洗膜3次，每次10 min；用质量分数为50 g/L的脱脂奶粉溶液室温封闭1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min。按推荐稀释比稀释一抗抗体，将膜放置于一抗中4 ℃孵育过夜，复温1 h后用TBST洗膜3次，每次10 min。按推荐稀释比稀释二抗抗体(HRP 标记的羊抗兔)室温下继续孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后按1∶1配制ECL显影液，采用凝胶成像分析系统检测蛋白条带，并用灰度分析软件定量分析。

1.3.4 MMP-2和TIMP-2的mRNA水平

采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测。首先按1.3.3项下步骤进行分组与加药，继续孵育24 h后提取每组细胞总RNA。MMP-2、 TIMP-2和β-actin引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表1。反应条件：预变性温度 95 ℃ 6 min；解链温度95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s，扩增温度95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 10 s进行45个循环。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 各组人结肠癌HCT116增殖率对比

与对照组同一时间点对比，蟾毒灵处理24，48，72 h后，人结肠癌HCT116增殖情况受到明显的抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)，并呈一定的浓度依赖性。见表2。根据蟾毒灵对HCT116增殖抑制的情况，为保证一定的有效性，并且排除蟾毒灵毒性对结肠癌细胞侵袭迁移实验的干扰，后续实验选用适中浓度(0.25,0.5,1 μmol/L)的蟾毒灵作用24 h进行研究。

组 别药物浓度/(μmol·L-1)检测时间点24 h48 h72 h对照组-99.33±2.08100.00±2.0099.67±3.51蟾毒灵组0.12586.37±6.03∗∗51.63±5.00∗∗28.95±3.51∗∗0.2585.41±5.00∗∗45.16±5.03∗∗28.29±8.54∗∗0.574.04±5.00∗∗40.37±5.00∗∗24.83±4.04∗∗144.28±5.03∗∗45.38±6.11∗∗27.50±3.51∗∗231.52±6.56∗∗32.23±10.00∗∗23.34±3.61∗∗

注：与同一时间点对照组对比， **P<0.01。

2.2 各组人结肠癌HCT116侵袭和迁移能力对比

与对照组对比，蟾毒灵(0.25,0.5,1 μmol/L)处理24 h后，HCT116的侵袭和迁移明显减弱，差异有统计学意义(P<0.01)。顺铂组的抑制侵袭和迁移能力最强，提示顺铂组具有阳性对照功能。1 μmol/L蟾毒灵组的抑制侵袭和迁移能力与顺铂组接近。见表3。

组 别药物浓度/(μmol·L-1)侵袭数目/个 迁移数目/个对照组-256.60±21.01329.67±27.57顺铂组2 mg·L-152.00±4.53∗∗140.00±17.69∗∗蟾毒灵组0.25178.00±40.62∗∗241.33±19.66∗∗0.5108.00±14.71∗∗231.33±9.50∗∗176.60±8.41∗∗180.33±12.66∗∗

注：与对照组对比，**P<0.01。

2.3 各组人结肠癌HCT116 MMP-2、TIMP-2 蛋白表达对比

HCT116经蟾毒灵(0.25,0.5,1 μmol/L)及顺铂(2 mg/L)处理24 h后，与对照组对比， MMP-2蛋白表达下降，TIMP-2 蛋白表达上调，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；蟾毒灵组呈浓度依赖性。见表4。

组 别药物浓度/(μmol·L-1)MMP2/β-actinTIMP2/β-actin对照组-1.54±0.101.05±0.15顺铂组2 mg·L-10.47±0.10∗∗1.93±0.11∗∗蟾毒灵组0.251.31±0.08∗1.26±0.200.51.08±0.10∗∗1.69±0.05∗∗10.16±0.10∗∗1.83±0.05∗∗

注：与对照组对比，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 各组人结肠癌HCT116 MMP-2、TIMP-2的mRNA表达水平对比

HCT116经蟾毒灵(0.25,0.5,1 μmol/L)及顺铂(2 mg/L)处理24 h后，与对照组对比， MMP-2的mRNA表达下降，TIMP-2的mRNA表达上调，差异有统计学意义(P<0.01)；蟾毒灵组呈浓度依赖性。见表5。

组 别药物浓度/(μmol·L-1)MMP-2 mRNA/β-actinTIMP-2 mRNA/β-actin对照组-1.00±0.011.00±0.01顺铂组2 mg·L-10.72±0.06∗∗1.71±0.14∗∗蟾毒灵组0.250.75±0.09∗∗1.32±0.06∗∗0.50.48±0.05∗∗1.41±0.08∗∗10.39±0.05∗∗1.62±0.05∗∗

注：与对照组对比， **P<0.01。

3 讨 论

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)又称基质素，具有水解细胞外基质结构的作用，在细胞生物活动中发挥多种关键作用，如胚胎发育、正常组织的重塑、创伤修复,以及血管生成，涉及动脉硬化。关节炎、溃疡及肿瘤的形成与发展[10]。其中，MMP-2在肿瘤的侵袭与迁移过程中的作用尤为关键[11]。研究表明,细胞外基质(extracellular matrix，ECM)不仅仅是细胞骨架，还是许多生物活性分子的贮存库。当ECM被MMPs降解时，胞外基质会释放众多生长因子，这些因子能够改变细胞表型。对于肿瘤细胞来说，获得具有侵袭性的细胞表型能够促使肿瘤细胞发生远端转移[12-13]。TIMPs是MMPs的天然特异性抑制剂，核磁共振成像技术从结构上解释了TIMPs的完整结构与抑制机制，TIMPs的整体形状就像一个楔子，能嵌入MMPs的活性位点裂隙中，并以类似底物的方式发挥抑制作用[14]。MMPs/TIMPs系统是肿瘤侵袭与迁移的关键调控系统，两者之间的平衡关系维持着ECM的稳定，并且TIMPs的异常表达与肠癌预后关系紧密[15]。

本实验中，笔者通过CCK-8实验检测了蟾毒灵对HCT116的增殖抑制能力，结果显示蟾毒灵对HCT116的抗增殖作用呈现明显的时间与剂量依赖性。为了避免高浓度、长时间的药物处理所引发的细胞死亡，后续实验笔者选择0.25,0.5,1 μmol/L蟾毒灵处理24 h来研究其对HCT116的抗侵袭和转移的作用。Transwell结果显示，蟾毒灵能够有效抑制HCT116的侵袭与迁移，结果具有统计学意义。在作用机制上，笔者检测了MMP-2和TIMP-2的蛋白表达与mRNA表达情况。Western blot结果显示，经蟾毒灵处理后，HCT116的MMP-2的蛋白表达水平下调，其天然抑制因子TIMP-2的蛋白表达水平上调。因此，笔者认为，蟾毒灵很可能是通过调节MMP-2蛋白水平抑制了结肠癌细胞的侵袭与迁移，其机制很可能是通过上调TIMP-2的表达实现的。进一步检测mRNA水平的变化，结果显示，经蟾毒灵处理的HCT116的TIMP-2的mRNA水平上调，说明蟾毒灵能够提高TIMP-2的转录，进而提高蛋白表达，并下调MMP-2的表达。

综上所述，本实验揭示了蟾毒灵抑制人肠癌细胞侵袭与迁移的新机制，即蟾毒灵通过上调TIMP-2的转录，从而上调蛋白表达，而TIMP-2蛋白表达水平增高又可抑制MMP-2的蛋白表达，进而发挥抑制人结肠癌细胞侵袭与迁移的作用。蟾毒灵调控TIMP-2的mRNA的机制还有待进一步研究，其中蟾毒灵与TIMP-2分子的构效关系值得深入研究。