牛膝总皂苷对类风湿关节炎大鼠Th17/Treg平衡和滑膜组织中IL-2、IL-6、TNF-α的影响*

宋献美，许 波，张欢欢，梁瑞峰

(1. 河南医学高等专科学校，河南 郑州 451191； 2.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是症状表现为关节滑膜慢性炎症、进行性骨破坏的自身免疫性疾病[1]，临床用药以糖皮质激素、非甾体抗炎药和抗风湿药为主，不良反应较多[2]。牛膝总皂苷为五环三萜类化合物，是中药牛膝的重要活性成分，可促进软骨细胞增殖发挥抗骨关节炎的作用[3]。调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)失衡是RA炎症病变及骨质破坏的重要原因。本研究通过类风湿关节炎模型，观察牛膝总皂苷对Th17/Treg平衡和滑膜组织中白介素2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响，探讨其治疗类风湿关节炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

雄性SPF级SD大鼠60只，体质量180～200 g，由河南省实验动物中心提供，合格证号SCXK(豫)2015-0004。

1.2 药品、试剂与仪器

牛膝总皂苷， 含量60.3%，购自陕西森弗生物技术有限公司，批号20180316；弗氏完全佐剂(批号SLBT1714)、牛源Ⅱ型胶原(批号17101015)，美国Sigma公司产品；荧光素异硫氰酸标记的抗大鼠CD4+抗体(CD4+-FITC，批号19001102)、藻红蛋白标记的抗大鼠IL17A抗体(IL17A-PE，批号51080609)、CD25-PE抗体(批号36034107)、CD127-PE(批号20610207)，均为美国BD公司产品；IL-2(批号20180913)、IL-6(批号20180726)、TNF-α(批号20180718)试剂盒,均为北京索莱宝科技有限公司产品。Synergy NEO型全功能酶标仪，美国BIO-TEK公司产品；FACSCalibur型流式细胞仪，美国BD公司产品；RM2245型病理切片机，德国Leica公司产品；CX-31型显微镜，日本Olympus公司产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

将大鼠按体质量随机分为正常对照组，模型对照组,牛膝总皂苷低、中、高剂量组5组，每组10只。除正常对照组外，其余大鼠采用Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂1∶1的混合乳剂于右后足底、背部、尾根3点共注射乳化剂0.1 mL的方法建立类风湿关节炎模型[4]。造模后第7 d，牛膝总皂苷低、中、高剂量组分别以牛膝总皂苷60，120，240 μg/g)灌胃，正常对照组和模型对照组灌胃等体积的纯水，1 d 1次，连续28 d。

1.4 检测指标

末次给药2 h后，眼眶取血并抗凝，麻醉后取右后踝关节，分离滑膜。

1.4.1 外周血Th17和Treg水平

以流式细胞术检测。用细胞分离液从抗凝血中分离淋巴细胞，1640培养液重悬后分别进行Th17和Treg的分析。Th17：加入佛波酯(2.5 mg/L)和离子霉素(1.0 mg/L)刺激，加入CD4+-FITC抗体1 μL，孵育20 min，清洗后加破膜剂孵育20 min，然后加入IL17A-PE抗体2 μL，避光孵育30 min，清洗2次。Treg：加入抗CD4+-FITC抗体2 μL、抗CD25-PE抗体2 μL和抗CD127-PE抗体2 μL，孵育30 min后清洗2次。上述处理完成后，均加入500 μL缓冲液重悬，流式细胞仪检测Th17和Treg水平。

1.4.2 滑膜组织中IL-2、IL-6和TNF-α水平

采用酶联免疫吸附法检测。精密称取50 mg滑膜组织，加入450 μL生理盐水匀浆，以ELISA 试剂盒测定滑膜组织匀浆液中IL-2、IL-6和TNF-α的水平。

1.4.3 踝关节组织病理学

大鼠踝关节组织经40 g/L 多聚甲醛固定，100 g/L EDTA溶液脱钙，脱水，透明，石蜡包埋，常规切片，苏木精-伊红染色，显微镜下观察踝关节组织病理学。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠外周血Th17和Treg水平对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠外周血中Th17水平升高，Treg水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，牛膝总皂苷中、高剂量组大鼠外周血中Th17水平降低，Treg水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

组 别Th17/%Treg/%正常对照组1.14±0.172.47±0.39模型对照组2.55±0.48∗∗1.05±0.21∗∗牛膝总皂苷低剂量组2.31±0.431.39±0.25##牛膝总皂苷中剂量组2.16±0.391.72±0.31##牛膝总皂苷高剂量组1.82±0.35##1.93±0.33##

注： 与正常对照组对比，**P<0.01；与模型对照组对比，##P<0.01。

2.2 各组大鼠滑膜组织中IL-2、IL-6和TNF-α水平对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠滑膜组织中IL-2、IL-6和TNF-α水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，牛膝总皂苷中、高剂量组大鼠滑膜组织中IL-2、IL-6和TNF-α水平降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表2。

组 别IL-2/(ng·g-1)IL-6/(ng·g-1)TNF-α/(ng·g-1)正常对照组64.37±14.6487.05±21.0873.61±18.11模型对照组113.29±28.05∗∗191.36±37.22∗∗216.17±43.20∗∗牛膝总皂苷低剂量组98.62±25.19173.36±33.15180.19±36.03牛膝总皂苷中剂量组86.39±24.07#145.07±30.39##146.24±29.17##牛膝总皂苷高剂量组77.53±20.26##121.43±26.58##117.32±24.80##

注： 与正常对照组对比，**P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 各组大鼠踝关节组织病理变化对比

光镜下显示：正常对照组大鼠关节结构完整，无炎性细胞浸润，未见滑膜增生，无骨及软骨破坏。模型对照组大鼠关节结构不完整，滑膜增厚，排列紊乱，大量炎性细胞浸润，血管扩张，可见骨及软骨破坏。与模型对照组对比，牛膝总皂苷高、中剂量组大鼠滑膜增生程度、炎症细胞浸润等均有不同程度改善，见图1。

A.正常对照组:结构完整，未见炎性细胞

B.模型对照组：滑膜增厚，细胞排列紊乱，可见大量炎性细胞

C.牛膝总皂苷低剂量组：滑膜结构破坏，炎性细胞较模型对照组减少

D.牛膝总皂苷中剂量组：细胞排列相对整齐，可见有炎性细胞浸润

E.牛膝总皂苷高剂量组：滑膜结构较完整，可见少量炎性细胞浸润

3 讨 论

类风湿关节炎是以慢性滑膜炎为特征的自身免疫性疾病。其发病原因是抗原对具有敏感遗传背景的人产生刺激后，发生免疫反应，但详细机制尚不清楚[5]。在RA患者体内，炎性细胞因子异常已得到验证，尤其是血清中TNF-α、IL-2和IL-6等促炎因子水平显著升高，并与RA病变程度呈正相关[6]。TNF-α由RA患者关节内滑膜的巨噬细胞分泌，可诱导滑膜成纤维细胞活化与增殖，促进破骨细胞的激活与骨吸收，并增加其他炎性细胞因子、黏附分子及骨与软骨破坏酶的表达[7]。IL-2在RA患者的血液及关节滑液中大量增加，不仅作为炎性因子参与关节滑膜损伤，还参与了全身的免疫平衡紊乱的病理进程[8]。IL-6由单核细胞、T细胞及滑膜细胞分泌，能促进类风湿细胞因子的产生，放大IL-1和TNF-α的促炎作用，加剧炎症程度，加重关节炎症病变[9]。本实验结果显示：RA模型大鼠较正常大鼠滑膜组织中IL-2、IL-6和TNF-α水平升高，牛膝总皂苷可降低滑膜组织中IL-2、IL-6和TNF-α的含量。

传统观点认为，调节Th1/Th2的平衡能够抑制RA的发生与发展，但单一的Th1/Th2平衡不能解释RA的复杂炎症机制[10]。最新研究提示，Th17/Treg分化平衡在RA中起着重要作用[11]。Th17通过产生强致炎因子IL-17来促进免疫细胞浸润关节滑膜并刺激滑膜成纤维细胞等分泌IL-2、TNF-α等促炎因子，引起血管翳形成，关节软骨遭到破坏，促进关节炎症进程。Treg通过分泌IL-10来抑制TNF-α等促炎因子的释放，阻止炎症进展，与Th17相互拮抗[12]。调控Th17/Treg的平衡可成为减轻类风湿关节炎炎症反应的重要策略。本实验结果显示：胶原诱导的类风湿关节炎模型大鼠较正常大鼠外周血Th17水平升高，Treg水平降低，牛膝总皂苷可下调外周血Th17水平，上调Treg水平。

综上所述，牛膝总皂苷可明显改善类风湿关节炎大鼠的关节组织病理变化，能降低滑膜组织中IL-2、IL-6和TNF-α水平，下调Th17水平，上调Treg水平。提示牛膝总皂苷可能通过逆转Th17/Treg的失衡、抑制炎症因子分泌来发挥治疗类风湿关节炎的作用。