补肾活血方对膝骨关节炎大鼠MMP-3、MMP-13及OPG/RANKL轴的影响*

李 斌，郭姝娜，张继胜

(1.镇平县中医院，河南 镇平 474250； 2.北京中医药大学东方医院风湿科，北京 100000)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)好发于中老年人，以渐进性、退行性的关节软骨破坏、骨赘形成及骨质增生等为主要表现，多发生于负重关节，尤以膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)最为多见[1]。研究表明，OA的发病机制可能与软骨细胞合成和分解之间的动态平衡被打破相关，由于磨损、负重、外伤等原因导致关节软骨破坏，能进一步加重软骨细胞胶原蛋白的降解，同时抑制软骨细胞的合成，二者相互作用，使得关节软骨出现糜烂、缺失等一系列改变的进行性加重[2]。近年来许多研究显示，OA的发病并非仅限于关节内软骨组织，与骨、软骨相关的滑膜、韧带及软骨下骨等都可能发生病理改变，而这些改变与机体免疫功能紊乱有着一定相关性[3]。本研究采用不同质量分数的补肾活血方干预KOA大鼠模型，观察该方对大鼠膝关节软骨组织中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)及骨保护素(osteoprotegerin，OPG)/核因子κB受体活化受体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)轴相关因子mRNA表达，以及对软骨退行性改变组织学分级评分(Mankin′s评分)的影响，探讨补肾活血方对KOA大鼠模型的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康雌性Wistar大鼠48只，体质量180～220 g，由北京斯贝福生物科技股份有限公司提供，许可证号为SCXK(京)2016-0002。饲养于南阳医学高等专科学校第一附属医院实验中心的屏障环境中，水瓶给水，自由进食。

1.2 药品、试剂与仪器

补肾活血方药物组成：骨碎补9 g，补骨脂10 g，桑寄生15 g，川牛膝12 g，鸡血藤15 g，丹参10 g，赤芍10 g。由镇平县中医院颗粒药房提供配方颗粒。依托考昔片，30 mg/片，杭州默沙东制药有限公司产品，批号H20080510；灌胃剂量根据大鼠与人的体表面积比值进行换算[4]。木瓜蛋白酶粉剂，25 g/瓶，北京索莱宝科技有限公司产品，批号Z26149871；SuperScript III RT反转录试剂盒，ABI-invitrogen公司产品，批号11752050。5810R型低温高速离心机，Eppendorf AG公司产品；核酸浓度测定仪，THERMO公司产品；7900型QPCR仪，ABI公司产品；EPS300电泳仪与2500凝胶成像仪，均为Biorad公司产品。

1.3 分组、模型的建立与给药

大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法随机分为正常对照组，模型对照组，依托考昔片组，补肾活血方小、中、大剂量组6组，每组8只。按照文献[5]分别于第1，4，7天向大鼠双侧后肢膝关节腔内注射质量分数 40 g/L的木瓜蛋白酶溶液各0.2 mL进行造模，正常对照组大鼠不予注射。最后一次注入木瓜蛋白酶溶液后第2天，随机选择2只大鼠进行双侧膝关节 X线检查，以确定造模是否成功。大鼠胫骨平台骨面出现不平整、欠光滑，且关节间隙变窄，视为造模成功。确认造模成功后，依托考昔片组给予依托考昔3.125 μg/g混悬液灌胃，补肾活血方小、中、大剂量组分别给予补肾活血方0.52，1.04，2.08 g/kg混悬液(10 g 颗粒方相当于81 g原药材)灌胃，正常对照组和模型对照组给予同体积蒸馏水灌胃，1 d 1次，连续4周。

1.4 检测指标

1.4.1 一般情况

实验期间，每天观察并记录大鼠的精神状态、饮食情况、活动情况，称量体质量。

1.4.2 软骨退行性改变组织学分级评分

灌胃4周后，采用100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉各组大鼠，用骨钳取右侧膝关节股骨髁，减去多余组织，常规切片脱蜡，苏木精染色4 min，体积分数10 mL/L 盐酸酒精分化液分色10 s，伊红染色3 min，脱水透明封片。镜下观察大鼠软骨的组织结构、软骨细胞及软骨下骨的变化。根据文献[6]对软骨进行包括表层软骨细胞分裂增生、细胞排列、软骨基质染色、潮线、血管翳样物生成5个方面的软骨退行性改变组织学分级评分(Mankin′s评分)。

1.4.3 膝关节软骨MMP-3、MMP-13、OPG、RANKL的mRNA表达

采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System ，QPCR)测定。灌胃4周后，采用100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉各组大鼠，剪开膝关节皮肤，取左膝关节腔内胫骨平台和股骨内外侧髁的退变区软骨约10 mg，置于1 mL Trizol中匀浆，加入氯仿200 μL剧烈震荡混匀，1 400 r/min 离心15 min，取上层水相，加入等体积异丙醇，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入体积分数750 mL/L的乙醇混匀，7 500 r/min 离心 5 min，弃上清液，用 50 μL DEPC水溶解沉淀，完成总RNA的提取。冰上进行逆转录后于ABI7900 QPCR仪上进行条带扩增，反应体系为：95 ℃预变性 2 min、94 ℃变性20 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，40个循环的条件进行QPCR反应，并在60～95 ℃对熔解曲线进行分析。将PCR产物与100 bp DNA Ladder进行质量分数20 g/L的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测 PCR产物是否为单一特异性扩增条带。扩增产物在150 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，紫外投射仪下观察扩增产物特异条带。QPCR反应结束后，根据得到的CT值采用2-ΔΔCt公式计算KOA大鼠膝关节软骨MMP-3、MMP-13、OPG、RANKL的mRNA表达。QPCR检测目的基因引物委托北京Invitrogen公司合成，具体序列见表1。

表1 引物序列

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况

实验期间所有大鼠在造模后，未出现伤口感染、破溃等情况，均存活。正常组大鼠状态良好，毛发光泽，饮水及进食量适中，双膝关节活动度自如，体质量在给药期间平稳上升; 其余各组大鼠在第1次造模后即出现饮水及进食减少；第2次和第3次造模后主动活动逐渐减少，双侧后肢膝关节活动受限，伴舔舐，毛发渐无光泽，体质量减轻。

2.2 各组大鼠膝关节软骨Mankin′s评分对比

与正常对照组对比，模型对照组和各药物组大鼠膝关节软骨Mankin′s评分升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，各治疗组Mankin′s评分有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)。各中药治疗组间具有一定剂量依赖性，大剂量组改善Mankin′s评分的效果最佳。见表2。

组 别n评分/分正常对照组80模型对照组810.96±0.55∗依托考昔片组88.73±0.34∗#补肾活血方小剂量组88.83±0.76∗#补肾活血方中剂量组87.57±0.91∗#补肾活血方大剂量组87.23±0.41∗#

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

2.3 各组大鼠膝关节软骨MMP-3、MMP-13、OPG、RANKL 的mRNA表达对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠MMP-3、MMP-13及RANKL mRNA表达均上调，而OPG mRNA下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，各药物组的MMP-3、MMP-13及RANKL的mRNA表达有不同程度下降，其中大剂量组与依托考昔片组类似；而依托考昔片组及中、大剂量补肾活血方组，OPG mRNA表达上升(P<0.05)，各中药治疗组间结果呈剂量依赖性。见表3。

组 别MMP-3 mRNAMMP-13 mRNAOPG mRNARANKL mRNA正常对照组0.64±0.370.71±0.171.37±0.210.68±0.11模型对照组1.67±0.83∗1.86±0.49∗0.82±0.22∗1.47±0.31∗依托考昔片组0.76±0.24∗#0.93±0.21∗#1.21±0.23∗#1.21±0.27∗#小剂量组1.17±0.42∗#1.17±0.19∗#0.91±0.31∗1.38±0.42∗中剂量组1.01±0.25∗#0.93±0.23∗#1.17±0.22∗#1.18±0.33∗#大剂量组0.87±0.27∗#0.91±0.21∗#1.19±0.36∗#1.07±0.16∗#

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

3 讨 论

膝骨关节炎多发于中老年人，虽一般不会直接引发残疾或对其他系统带来损伤，但其所致的疼痛、行动不便等是影响患者生活质量、造成患者生理和心理双重负担的重要原因[7]。西医治疗KOA常用消炎止痛药物，如依托考昔、塞来昔布等。依托考昔作为一种选择性环氧化酶-2抑制剂，能有效缓解KOA患者的关节疼痛症状，减轻患者体内炎症因子水平[8]，但有一定的消化道刺激、水肿等不良反应的发生率。中医药治疗KOA具有一定优势，在改善患者关节疼痛、保证疗效的基础上，还能改善关节软弱无力、多汗等症状，且有较高的安全性，不良反应发生概率低[9]。

MMP是一种能降解细胞外基质的基质水解酶，其中MMP-3的降解底物为明胶、蛋白聚糖、Ⅱ和Ⅲ型胶原等，MMP-13的降解底物为Ⅰ、Ⅱ型胶原，均能导致软骨的破坏，引起骨关节炎的进行性加重[10]。OPG具有骨保护作用，能对破骨细胞的分化产生抑制；而RANKL与之作用相反，能促进破骨细胞的分化和增殖，使得骨破坏进一步加重。两者共同调节着骨骼的生长与重建,其动态平衡保证着骨关节的正常功能。调控这些因子能起到治疗骨关节炎的作用。

KOA属中医学“骨痹”范畴，以肝肾亏虚为本，脉络痹阻为标。本虚导致患者易受外邪侵袭，邪气留存经络，痹阻不除，不通则痛。补肾活血方将补肾活血与通络止痛有机地结合起来，一方面用鸡血藤、丹参、赤芍等活血通络，血脉通则疼痛除；另一方面用骨碎补、补骨脂、桑寄生、川牛膝等补益肝肾，强筋健骨，补肝肾之虚则正气充沛，腰膝强劲，并能抵御外邪。本实验中，补肾活血方能降低KOA模型大鼠膝关节软骨Mankin′s评分，说明该方对大鼠关节软骨的损伤具有一定的修复作用；能提高模型大鼠膝关节软骨内OPG的mRNA表达，降低MMP-3、MMP-13和RANKL的mRNA表达水平，说明该方可能是通过调节关节腔内的骨代谢平衡来改善关节软骨损伤、延缓骨关节炎病情的进展。本研究丰富了补肾活血方治疗KOA的理论基础，为临床运用该方治疗KOA提供了理论依据。