京尼平和甲醛缓释体类防腐剂对活体兔巩膜交联的有效性研究

许寅聪 陈静 赵亚芳 王超英 仝春梅 刘迎庆 韩宝雁

高度近视已经引起了全社会的关注，近年全世界高度近视患者数量急剧增长，预测到2020年全球约有20亿的近视患者[1,2]，这势必严重干扰了社会的正常发展。中国是高度近视的高发国家，患病率为6.69%～38.4%[3-5]。近视之所以引起全社会的关注是因为高度近视是常见的致盲性眼病，且在致盲性眼病中的比例迅速增长。尤其是病理性近视患者，因后巩膜终生持续扩展，眼轴终生增长，最终引起眼球后段局限或大面积缺血，进而损害视网膜功能，并诱发并发症的发生[6,7]。既往一些研究表明病理性近视的发生及并发症的出现与巩膜的生物力学降低有关[8,9]。随着核黄素-紫外光A角膜胶原交联手术治疗圆锥角膜技术的应用并取得良好的临床效果[10,11]，使得病理性近视的研究有了新的方向，增强巩膜生物力学的研究也成为了新的热点，研究是希望通过增强后部1/2巩膜的应力、应变、弹性模量等，起到阻止或延缓后巩膜持续扩展的作用，最终实现治疗病理性近视的目的[12,13]。京尼平是一种低毒性和优良生物相容性的天然交联剂，我们既往研究也发现其具备较强的巩膜交联效应[14]。本研究希望通过直接对比研究甲醛缓释体类防腐剂和京尼平对活体成年兔巩膜交联后的后巩膜生物力学强度的改变来衡量其有效性，最终筛选出具有较强巩膜胶原交联效应的药物。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康新西兰大白兔，数量100只，来源为河北医科大学实验动物中心，年龄约为1年龄，雌雄不限，体重为(1.69±0.14)kg，饲养地点为联勤保障部队第九八○医院动物实验中心，有中心饲养员进行饲养，饲养环境为室温20～23℃，每日接受日光或灯光12 h。入组前经过便携式笔形手电逐步检查每只兔双眼外眼睑、角膜和瞳孔均未见明显异常。本研究所涉及的所有兔动物试验都已经取得中国人民解放军联勤保障部队第九八○医院动物实验伦理委员会批准(批准编号2018-KY-09)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及模型建立:将100只兔随机分为5组(随机数字表法)，每组20只，分别为 3组FARs药物组(羟甲基甘氨酸钠组、重氮咪唑烷基脲组、恶唑烷组)，京尼平组和空白对照组。右眼为实验眼(由抛硬币法选出)。给药方法为：选择鼻上1∶00和颞下7∶00位角膜缘后3 mm进针Tenon’s囊下各1次，左眼均未予以任何处理。见表1。

表1 京尼平和甲醛缓释体类防腐剂给药浓度及剂量 n=20

1.2.2 巩膜生物力学参数测量

1.2.2.1 样本制备:最后一次给药后60 d，5组兔体重见表2(F=0.779，P=0.549)。耳前静脉空气栓塞法逐组处死动物兔，摘取实验眼球，保留眼外肌和视神经，并编号标记，然后按操作顺序依次放入保存液1中，成分为25%的新生牛血清、2.5%的蔗糖、2%的DMSO、灭菌注射用水；保存液2，成分为25%的新生牛血清、5.5%的蔗糖、4%的DMSO、灭菌注射用水；保存液3，成分为25%的新生牛血清、7.5%的蔗糖、6%的DMSO、灭菌注射用水，每眼球在这3种保存液中均浸泡10 min，最终放入保存液4中，成分为25%的新生牛血清、10%的蔗糖、7.5%的DMSO、灭菌注射用水。之后带保存液4放入编号的保存盒中密封，之后放入液氮罐中保存。连同液氮罐一起运输到太原理工大学国家力学实验室中，将密封在保存液4中的兔眼从液氮罐中取出，放入37℃恒温水浴箱中复温2 h，取标本1∶00和7∶00位眼外肌止端后的巩膜，制成长10 mm宽5 mm的长方形巩膜条带。见表2。

组别体重羟甲基甘氨酸钠组1.61±0.19重氮咪唑烷基脲组1.67±0.14恶唑烷组 1.69±0.10京尼平组 1.67±0.13空白对照组 1.66±0.17

1.2.2.2 生物力学的测试:首先逐条测量巩膜条带的厚度，测量仪器由力学实验室提供，测量3次，取均值，所有测量由同一人完成，之后将巩膜条带用夹具固定好两端，微调夹具，使试件松紧适度，并实时观察拉力情况，以静止时拉力为-0.5～+0.5 N为标准，然后测量固定好的巩膜条带长度并按照编号记录，使用INSTRON 5544型万能材料试验机进行力学实验，实验程序顺序为蠕变实验，预拉伸实验，拉伸强度实验、拉伸破坏实验，试验期间保持巩膜条带湿润，之后计算出试件弹性模量、蠕变率、极限应力和极限应变。

2 结果

2.1 巩膜厚度 实验后5组巩膜厚度差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

组别巩膜厚度(mm)羟甲基甘氨酸钠0.30±0.04重氮咪唑烷基脲0.29±0.07恶唑烷 0.32±0.03京尼平组 0.31±0.05空白对照组 0.30±0.03F值1.375P值0.249

2.2 极限应力 4个试验组的极限应力均较空白组增大，且差异有统计学意义(P<0.05)。其中羟甲基甘氨酸钠表现出最强的交联能力，极限应力增强最明显为(1.33±0.50)MPa，为空白对照组的2.18倍。其次表现较好的为重氮咪唑烷基脲组和恶唑烷组。表现最差的京尼平组。三种FARs药物(羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲组、恶唑烷组)与京尼平相比较增强极限应力的能力差异有统计学意义(P<0.05)，FARs更强效。见表4，图1。

组别极限应力(MPa)羟甲基甘氨酸钠1.33±0.50∗#重氮咪唑烷基脲1.28±0.37∗#恶唑烷 1.23±0.35∗#京尼平组 0.86±0.31∗空白对照组 0.61±0.27F值13.781P值<0.001

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与京尼平组比较，#P<0.05

图1 试验后不同药物分组的巩膜极限应力情况

2.3 极限应变 4个试验组极限应变均较空白组出现了显著的降低，且差异均有统计学意义(P<0.05)。其中重氮咪唑烷基脲组表现出最强的交联能力，极限应变为(28.04±7.45)%，较空白对照组降低了27.05%。其次表现较好的为羟甲基甘氨酸钠组和恶唑烷组。表现最差的为京尼平组。三种FARs药物(羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲组、恶唑烷组)与京尼平相比较，重氮咪唑烷基脲组能更显著的降低极限应变(P=0.035)。见表5，图2。

组别极限应变(%)羟甲基甘氨酸钠30.19±7.91∗重氮咪唑烷基脲28.04±7.45∗#恶唑烷 29.83±5.55∗京尼平组 32.32±5.97∗空白对照组 38.44±4.81F值8.086P值<0.001

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与京尼平组比较，#P<0.05

2.4 弹性模量变化 4个试验组弹性模量均较空白组出现了增加，其中羟甲基甘氨酸钠组表现出最强的交联能力，弹性模量为(7.70±1.94)MPa，为空白对照组的2.14倍。其次表现较好的为重氮咪唑烷基脲组和恶唑烷组。表现最差的京尼平组。3种FARs药物(羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲组、恶唑烷组)与京尼平相比较增强弹性模量的能力差异有统计学意义(P<0.05)，FARs更强效。见表6，图3。

图2 试验后不同药物分组的巩膜极限应变情况

组别弹性模量(MPa)羟甲基甘氨酸钠7.70±1.94∗#重氮咪唑烷基脲7.21±1.84∗#恶唑烷 7.15±1.31∗#京尼平组 5.00±1.11∗空白对照组 3.60±2.84F值26.459P值<0.001

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与京尼平组比较，#P<0.05

图3 试验后不同药物分组的巩膜弹性模量情况

2.5 蠕变率 4个试验组蠕变率均较空白组出现了显著的降低，且差异均有统计学意义(P<0.05)。其中恶唑烷组的蠕变率最低为(7.69±2.68)%，较空白对照组降低了34.92%。其次表现较好的为重氮咪唑烷基脲组和羟甲基甘氨酸钠组。表现最差的为京尼平组。3种FARs药物(羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲组、恶唑烷组)与京尼平相比较，恶唑烷组能更显著的降低极限应变(P=0.004)。见表7，图4。

组别蠕变率(%)羟甲基甘氨酸钠8.26±3.19∗重氮咪唑烷基脲9.12±2.51∗恶唑烷 7.69±2.68∗#京尼平组 9.36±2.10∗空白对照组 11.82±1.58F值15.388P值<0.001

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与京尼平组比较，#P<0.05

图4 试验后不同药物分组的巩膜蠕变率情况

3 讨论

病理性近视的发病机制仍不清楚，但已经有研究表明病理性近视的发生发展与巩膜的生物力学下降和巩膜自身解构特点有关，从眼球自身解剖来看视网膜、脉络膜、巩膜构成了眼球的大部分外壳，从生物力学性能来看，在相同应力的作用下，三层结构切线模量呈数量级递增[15]。在病理性近视的发展过程中，巩膜各层生物力学出现改变表现出显著下降，当巩膜生物力学性能下降出现扩张的时候，视网膜、脉络膜会紧跟着出现快速扩张，进而引起一系列高度近视病变，比如黄斑部新生血管和(或)出血、视网膜(黄斑)劈裂、视网膜脱离、视网膜(黄斑)裂孔、后巩膜葡萄肿等，进而引起视功能的明显损害[16]。遗憾的是目前临床上尚无公认有效地治疗或控制病理性近视发生发展的手段，应用相对广泛的是后巩膜加固术[17,18]，其可以保持或提高患者最佳矫正视力、阻止或延缓眼轴进一步增长[19]，但长期效果、手术方法、加固材料选择方面尚存争议[20]。有学者也发现了部分与病理性近视有关的基因[21,22]，如PAX6基因、LUM基因、IGF基因、转化生长因子-β1、rs2536等30多个位点基因，但距离临床应用仍待时日，所以探索新的治疗方法迫在眉睫。

巩膜胶原交联是近年的一个研究概念，这是受到核黄素-紫外光A角膜胶原交联手术治疗圆锥角膜所启发。巩膜交联治疗病理性近视的原理是通过物理或者化学方法增强巩膜的生物力学强度，进而缓解巩膜扩展，延缓眼球增长，进而达到控制病理性近视致盲的目的。本研究就是探讨化学药物方法的巩膜交联有效性。探讨了2类药物，第一类是甲醛缓释体类防腐剂(FARs)，其是一类化合物，约有100多种，广泛应用于洗护用品、纺织等产品中，我们日常生活中时刻都在接触此类化合物，但未见到其直接致癌的报道，欧盟对各种FARs的安全剂量有着较为明确的限定，我们前期通过查阅文献初步筛选除了5种较为有潜质的FARs，第二类是京尼平，京尼平是一类提取自天然植物的化合物，有着良好的安全性。Babar等[23]通过观察FARs交联后巩膜的热变性温度和FARs对人皮肤成纤维细胞的毒性反应认为其是强效、低毒性的交联剂。本实验选择的FARs药物种类是参照了既往研究[24]，浓度则参考了欧盟理事会关于FARs的法令，选择的是1/10最大允许安全浓度。动物模型选择兔是因为，本课题组具有成熟的幼兔形觉 剥夺模型建立的经验，同时成年兔标本容易获得，体重易控制，故本文则对这4种药物的有效性进行了活体兔试验研究。

从本研究结果看，京尼平和三种FARs药物(羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲、恶唑烷)均表现出了明显的交联效应，巩膜的生物力学的强度明显增强了，这包括极限应变、极限应力、弹性模量和蠕变率4个方面均有了显著增强。但要知道这些交联药物的交联效果都与浓度正相关。在1/10最大允许浓度下的四种生物力学指标来看，极限应力最多增大2.18倍(羟甲基甘氨酸钠组)、极限应变最多降低27.05%(重氮咪唑烷基脲组)、弹性模量最多增大2.14倍(羟甲基甘氨酸钠组)、蠕变率最多降低34.92%(恶唑烷组)。京尼平组极限应力增大1.41倍，极限应变降低16%，弹性模量增大1.39倍，蠕变率降低20.81%。这点与国内外学者既往研究类似。Campbell等[25,26]研究认为京尼平巩膜交联可增强巩膜生物力学强度60%。Zyablitskaya等[27]发现羟甲基甘氨酸钠的巩膜交联效应具备明显的浓度效应，400 mmol/L浓度的药物交联强度是40 mmol/L的6倍。除了本实验研究的化学药物巩膜交联，贾冠美[28]开展了核黄素-紫外光A角膜物理胶原交联，发现使用功率3.0 mW/cm2，波长370 nm的紫外线灯联合0.1%的5-磷酸核黄素，对兔巩膜照射20 min的方法，兔巩膜弹性模量增加了26.31%，极限应力增加了12.21%，蠕变率降低了40.47%。Liu等[29]对豚鼠进行了UVA-核黄素巩膜胶原交联实验结果也发现能显著增强巩膜生物力学强度。

本研究通过对活体兔后Tenon’s囊下注射羟甲基甘氨酸钠、重氮咪唑烷基脲、恶唑烷和京尼平4种药物后巩膜生物力学参数的研究发现，4种药物均具备较强的巩膜胶原交联效应，能够显著提高后巩膜生物力学强度，具备治疗病理性近视的潜能。综合数据来看FARs较京尼平具备更显著的增强巩膜生物力学强度的能力，但因为化学交联效应与浓度正相关，所以这可能与不同种类药品的浓度差异有关。我们也会在未来增加安全性相应内容，最终探索出临床急需的治疗病理性近视可行性的方法，为患者带来持久的光明。