核受体共激活因子7在槟榔碱诱导的上皮间充质转化中的生物学功能

刘清辉，何黎明

口腔黏膜下纤维性变(oral submucous fibrosis，OSF)是咀嚼槟榔导致的一种慢性、隐匿性的口腔黏膜潜在恶性病损(oral potentially malignant disorders, OPMDs)，癌变率为3.02%～9.13%[1-6]。在OSF发病期间，槟榔刺激上皮细胞及炎性细胞产生应激反应[7]，同时产生多种上皮转化促进因子[8]，抑制上皮细胞增殖，诱导上皮细胞转化及凋亡[9]，导致组织纤维化进一步发展。

上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是一种表型转换过程。在EMT过程中，上皮细胞失去其特征性标志物并获得间充质或肌纤维细胞表型，增殖及迁移能力增加。EMT在以肺[10]、肾[11]为代表的多种器官纤维化中已有较为深入的研究。通过基因芯片与PCR技术，研究者发现槟榔碱可刺激EMT相关分子异常表达[12]。但EMT是否在OSF发生发展中发挥着重要作用亟待进一步研究。

核受体共激活因子7(nuclear receptor coactivator 7，NCOA7)，也被称为ERAP140，具有激动剂依赖性。前期研究发现NCOA7在口腔鳞癌组织中呈现高表达，且可调控细胞增殖、迁移等多种生物学功能[13]，但其在OSF组织中的异常表达罕见报道。本研究探究NCOA7与EMT在口腔黏膜下纤维性变发生发展中的关系及作用，为治疗OSF提供新思路。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集2016—2017年在中南大学湘雅二医院收治符合世界卫生组织诊断标准，且无其他口腔黏膜性疾病、其他系统性疾病的OSF患者病损组织30例和外科手术中切除的非炎性正常口腔黏膜组织15例。根据临床表现和病理学检查，所有OSF患者均收集的组织置于-70 ℃冰箱中保存。

1.2 实验试剂

人口腔角质细胞株HOKs(Human Oral Kera-tinocytes)由中南大学湘雅二医院中心实验室惠赠。 DMEM高糖培养液、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司，美国)；BCA蛋白定量试剂盒(联科生物公司，中国)；CCK8细 胞 增 殖 及 细 胞 毒 性 检 测 试 剂 盒(同仁公司，日本)；NCOA7兔多克隆抗体、E-cadherin兔多克隆抗体、Vimentin兔多克隆抗体、α-SMA兔多克隆抗体(Abcam公司，美国)；GADPH兔多克隆抗体、兔二抗(Proteintech公司，美国)；免疫组化DAB显色试剂盒(DAKO，美国)。

1.3 细胞培养

HOKs细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃，体积分数为5%CO2且湿度饱和的环境下进行培养。

1.4 免疫组化

组织固定包埋制作标本切片,经脱蜡经EDTA抗原修复缓冲液(pH=9.0)行抗体修复。3%过氧化氢室温孵育，PBS洗涤，封闭。PBS稀释的一抗，4 ℃过夜。二抗37 ℃孵育1 h。PBS充分洗涤，DAB显色，适时终止；复染，冲洗，返蓝，脱水，透明，封片。所有标本均在同一条件下染色。

免疫组织化学染色结果判读：每例随机选取10个高倍视野计数，染色分值及结果记录如下：低表达记为1分(阳性率≤25%)，中度表达记为2分(25%<阳性率≤75%)，高表达记为3分(阳性率>75%)。

1.5 CCK8实验

收集HOKs，调整细胞密度为2.5×104个/L，各组设6个复孔。每孔加入200 μL细胞悬液，加入10 μL/孔CCK8工作液， 37 ℃孵育3 h。测定450 nm波长下各孔的吸光度A值。重复3次，并绘制细胞生长曲线。

1.6 Western blot

提取细胞的总蛋白，8%SDS-PAGE凝胶电泳，转膜。5%脱脂牛奶封闭，NCOA7一抗(1∶1 000)、actin一抗(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000)和E-cadherin一抗(1∶1 000)4 ℃过夜。TBST洗涤，兔二抗(1∶5 000)常温孵育1 h。TBST洗涤，ECL化学发光法显像并保存图像。

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0、GraphPadprism 7.0统计软件进行数据分析。NCOA7在OSF组织及正常黏膜组织中的相对表达水平采用Fisher确切概率法。其余实验多组数据比较用One-way ANOVA检验，组间数据比较采用独立样本t检验。检验水准取α=0.05，采用双侧性检验。

2 结 果

2.1 口腔黏膜下纤维性变中存在上皮间充质转化及NCOA7水平的升高

免疫组化结果显示：在正常黏膜基底层中甚少表达的间充质标记物Vimentin在OSF组织中表达升高(图1；χ2=11.379，P<0.05)，而E-cadherin表达降低(图2；χ2=11.857，P<0.05)，提示在OSF中可能存在上皮间充质转化。

NCOA7免疫组化结果显示：NCOA7在正常黏膜组织中少量表达，而于OSF上皮组织中多呈强阳性(图3；χ2=39.482，P<0.05)。

图1 免疫组化检测Vimentin在OSF及正常组织中的差异表达

2.2 槟榔碱对人口腔角质细胞株HOKs增殖能力的影响

CCK8实验显示，加入5 μg/mL槟榔碱后，HOKs增殖速率减缓，且随着浓度的增高，增殖速率愈加缓慢，由此提示我们，槟榔碱对HOKs具有一定的抑制增殖作用。根据细胞活力=[A槟榔碱组-A空白组]/[A未加槟榔碱组-A空白组]×100%绘制曲线，可推算出EC50在7.00～13.00 μg/mL，故而本次实验选用10 μg/mL槟榔碱为中心浓度处理HOKs(图4)。

图2 免疫组化检测E-cadherin在OSF及正常组织中的差异表达

图3 免疫组化法检测NCOA7在OSF及正常口腔黏膜上皮中的表达

2.3 NCOA7在HOKs中的表达随槟榔碱浓度升高而升高

以10 μg/mL为中心设置浓度梯度(0，5，10，20 μg/mL)，用不同浓度梯度的槟榔碱刺激HOKs，24 h后提取总蛋白进行Western blot，实验得出：NCOA7随着槟榔碱的浓度升高而升高，相较于0 μg/mL组，10 μg/mL组(t=5.839，P=0.004 3)与20 μg/mL组(t=5.864，P=0.004 2)均具有统计学差异(图5)。

图4 槟榔碱对HOKs增殖能力的影响

2.4 槟榔碱对HOKs中上皮及间充质标记物蛋白表达水平的影响

10 μg/mL的槟榔碱刺激HOKs 24 h后，E-cadherin的蛋白表达水平随槟榔碱浓度升高逐渐下调，而Vimentin，α-SMA蛋白表达水平则随着槟榔碱浓度升高而逐步升高(图6)。

2.5 沉默NCOA7(siNCOA7)对HOKs中上皮及间充质标记物蛋白表达水平的影响

siNCOA7转染HOKs 48 h后，上皮标记物E-cadherin的蛋白表达水平明显下降，而内皮标记物α-SMA蛋白表达水平则随着NCOA7的表达抑制而升高(图7)。

3 讨 论

OSF发病率高、可癌变，严重影响患者的生存质量，主要临床表现有口干、黏膜烧灼感、反复水疱、黏膜大理石花纹样变及张口受限等。槟榔碱是槟榔中的有效成分之一，研究表明槟榔咀嚼者唾液内槟榔碱浓度均有不同程度升高，30%患者可超过10 g/L[14]。槟榔碱是OSF的关键致病因子， 对上皮细胞具有生物学毒性，可引发上皮转化，促进OSF的发生发展，而抗氧化的中药成分参与抑制槟榔碱诱导的EMT过程[15]。

图5 槟榔碱刺激下NCOA7蛋白表达水平变化

图6 不同浓度梯度的槟榔碱对上皮及间充质标记物蛋白表达水平的影响

有学者通过转基因小鼠追溯成纤维细胞来源，发现EMT是纤维化疾病中成纤维细胞的重要来源之一[16]。但EMT在口腔黏膜下纤维性变中所产生的生物学作用，仍待进一步验证。在本实验中，我们通过免疫组化检测OSF组织和口腔黏膜正常组织中的上皮及间充质标志物表达水平(图1)， 发现间充质标志物，如Vimentin在OSF组织中的表达明显高于正常组织；上皮标志物，如E-cadherin表达显著低于正常组织，提示OSF发生发展过程中可能存在上皮细胞间充质转化。E-cadherin是细胞维持上皮表型的重要粘附分子。在EMT过程中，上皮细胞失去上皮细胞特异性标志物，细胞间的粘附性下降，细胞骨架重塑，出现间充质细胞样表型。在许多慢性纤维化疾病中，EMT均发挥了重要的生物学作用。在口腔黏膜下纤维性变中，促进EMT进程的ZEB家族、转录因子超家族均有不同程度的异常表达，且这些分子的表达异常与细胞癌变、侵袭能力等生物学行为息息相关[17-18]。

图7 沉默NCOA7后对上皮及间充质标记物蛋白表达水平的影响

EMT与包括口腔癌在内的多种肿瘤的转移息息相关。随着E-cadherin蛋白表达的下降，肿瘤细胞与周围细胞粘附力下降，侵袭能力上升。同时，有研究表明NCOA7在OSF所致的癌变组织中高表达，影响着细胞的增殖、侵袭等生物学行为[13]。NCOA7具有激动剂依赖性，可参与炎症因子信号通路及氧化应激反应[19-20]，并与部分癌症的患癌风险息息相关[21]。近年来，部分学者认为可将OSF视作早期癌变的模型[22]，而NCOA7是否在OSF中也存在着异常表达目前鲜见报道。在本研究中，我们通过免疫组化及Western blot方法分析发现NCOA7在OSF组织，尤其是上皮组织中的表达明显高于口腔黏膜正常组织。进一步，我们利用不同浓度槟榔碱处理HOKs，发现随着槟榔碱浓度的升高，NCOA7蛋白水平不断升高；同时，随着NCOA7的变化，HOKs中的上皮标记物下降、间充质标记物升高。NCOA7属于抗氧化基因OXR家族中的一员，包含1个TLDc结构域，可参与调控细胞氧化应激。许多证据表明氧化应激在口腔黏膜下纤维性变[23]及EMT过程[24]中发挥着重要的作用。而NCOA7可能通过调控上皮间充质转化进而参与OSF的发生发展过程，其具体生物学功能及机制仍需进一步探索。

综上所述，NCOA7、E-cadhern、Vimentin的异常表达可能与OSF发生发展有密切的关系。而分子间是否具有相互反馈机制是我们需要进一步探索的方向。已有少量研究证明NCOA7与EMT相关分子参与癌变过程，本研究发现NCOA7、EMT相关分子在OSF组织及槟榔碱刺处理后的细胞中异常表达，而这些分子可能参与口腔黏膜下纤维性变的发生发展甚至早期癌变过程，为口腔黏膜下纤维性变的诊治提供了新思路。