细胞衰老分子机制的研究进展

徐 舜，崔红晶，赵 炜，孙雪荣，袁 源，郑婷婷，熊 兴东，刘新光 （广东医科大学衰老研究所，广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 523808）

人口老龄化已成为当今世界各国面临的日趋严重的社会问题。衰老作为生命过程中的一种生理现象，是指随着个体年龄的增长，细胞、组织、器官发生系统性病变，从而导致衰老相关疾病发生和寿命终结的现象，主要表现为细胞的增殖能力减退，甚至完全停滞，脏器萎缩、机能衰退等[1-2]。与衰老密切相关的疾病，如糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病、肿瘤、代谢性疾病等，已成为人类健康的重要威胁。2013年法国学者提出了衰老的九大分子指标：(1)基因组不稳定；(2)端粒缩短；(3)表观遗传学改变；(4)蛋白内稳态丧失；(5)营养感应失调；(6)线粒体功能异常；(7)细胞衰老；(8)干细胞耗竭；(9)细胞间通讯改变[1]。细胞衰老是指细胞在执行生命活动过程中，随着时间的推移，细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程[1-2]。最近有文献指出，细胞衰老是一种由压力信号刺激产生，存在于特定生理过程的细胞状态，具有典型的细胞周期停滞、衰老相关分泌表型、大分子损伤及代谢紊乱4大特征[3]。细胞衰老涉及的分子机制较多，氧自由基学说认为细胞衰老是机体代谢产生的氧自由基对细胞损伤的积累[4]。端粒学说提出细胞染色体端粒缩短的衰老生物钟理论，认为细胞染色体末端特殊结构-端粒的长度决定了细胞的寿命。DNA损伤衰老学说认为细胞衰老是DNA损伤的积累。基因衰老学说认为细胞衰老受衰老相关基因的调控。分子交联学说则认为生物大分子之间形成交联导致细胞衰老，也有学者认为，脂褐素蓄积、糖基化反应以及细胞在蛋白质合成中难免发生的误差等因素导致细胞衰老。对于衰老的生物学机制的深入研究，既是当前生命科学领域的重要前沿，又是社会经济和医疗卫生发展面临的重大挑战。由于人类的生命周期较长，正常的衰老过程不易研究，因此衰老研究通常利用衰老动物模型(如酵母、线虫、斑马鱼、小鼠等)完成，进而揭示衰老过程的分子机制。

本课题组自2006年开始从事衰老及其相关疾病的分子机制研究，我校于2007年成立了衰老研究所，10多年来在细胞衰老的分子机制的研究方面获得了14项国家自然科学基金项目，开展了系列研究。本文将结合本课题组的工作就细胞衰老的分子机制作一综述。

1 非编码RNA与细胞衰老

长期以来，人们对细胞衰老分子机制的研究主要集中在蛋白编码基因。然而，在高等哺乳动物转录产物中，90%以上是非编码 RNA(non-coding RNA，ncRNA)，主要包括微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和环状RNA(circular RNA，circRNA)等。非编码RNA可在表观遗传、转录水平以及转录后水平等多层次调控基因的表达，从而广泛参与多种生物学过程。近年来，非编码RNA在细胞衰老中的作用日益受到关注，并取得了长足发展。

miRNA是一类高度保守的、长度约为22 nt的非编码小RNA分子，通过与靶基因mRNA 3'UTR的结合，引起mRNA的降解或者翻译阻滞，从而在转录后水平实现对靶基因的负调控[5]。越来越多的研究显示，miRNA在细胞衰老过程中发挥至关重要的作用，miR-34a[6]、 miR-29[7]、 miR-217[8]及miR-17-92家族[9]等多个miRNAs可通过负调控衰老相关信号通路中的靶基因影响细胞衰老进程。近年来，本课题组揭示了包括miR-365、miR-33和miR-124等多个miRNA在细胞衰老与早老中发挥重要作用。

LncRNAs是一类转录本长度大于200个核苷酸，缺乏蛋白质编码能力的功能性RNA分子[10]，最初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具有生物学功能。但近年的研究表明，lncRNAs能与蛋白直接相互作用，并在多个层次调节靶基因的表达或相互作用蛋白的稳定性、活性等，从而参与调节细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程[11]。LncRNAH19可通过抑制STAT3信号通路，参与调节内皮细胞衰老[12]。MIR31HG则可通过调节P16蛋白的表达影响细胞衰老进程[12]。此外，lncRNA-OIS1可通过激活DPP4从而促进RAS诱导的细胞衰老(OIS)[14]。本课题组发现长链非编码RNA AK156230可参与调节小鼠胚胎成纤维细胞复制性衰老进程[15]。

环状RNA是一类具有闭合环状结构的内源性RNA分子，主要由前体RNA(pre-mRNA)通过可变剪切加工产生。它广泛存在于各种细胞中，具有表达丰度高、结构稳定和组织特异性表达等特征[16]。越来越多的研究表明，circRNA可作为miRNA和蛋白质“海绵”调控相应靶基因的表达，或者通过与核内蛋白结合形成转录复合物调控基因转录等方式发挥其生物学功能[16]。有研究表明，环状RNA在细胞衰老的过程中发挥重要的作用。例如，Panda等[17]在人二倍体成纤维细胞WI-38中发现大量与衰老相关的环状RNA(SAC-RNAs)。其中，circPVT1可通过ceRNA的作用方式抑制let-7的活性并调控其靶基因的表达，从而影响细胞的增殖和衰老[17]。Du等[18]发现circ-Foxo3在年老的人与小鼠心脏中高表达。体外实验表明，沉默circ-Foxo3可抑制小鼠胚胎成纤维细胞的衰老，而过表达circ-Foxo3可诱导其衰老。过表达circ-Foxo3导致抗衰老蛋白ID1、转录因子E2F1、抗应激蛋白HIF1a和FAK滞留于胞质，而在胞核中的丰度降低，从而阻断这些蛋白质发挥抗心肌细胞衰老的功能。此外，还有研究发现，circFoxo3与CDK2和p21结合，形成circFoxo3-p21-CDK2三元复合物，从而抑制CDK2的功能并阻止细胞周期进展[19]。近年来本课题组非编码RNA与细胞衰老进程研究详见表1[20-25]。

2 细胞应激反应与衰老

细胞和机体在生长过程中难免会受到内外各种环境的影响，例如氧化应激、内质网应激、渗透压力、热应激、营养/代谢压力、DNA损伤等[26]。细胞因此进化出一系列适应性的调控机制，影响相关基因的表达，这种反应称为细胞应激。如果细胞内的这套应激调控机制失衡，就会导致细胞死亡，衰老或癌变[27]。

研究发现，在机体衰老和衰老相关疾病发生过程中，细胞内的应激反应和相应的修复机制都出现紊乱趋势[28]。从某种程度上来说，衰老是细胞损伤和修复机制之间的博弈[29]。

表1 近年来本课题组非编码RNA与细胞衰老进程研究进展

细胞应激反应与衰老之间存在着较为复杂的关系，长寿细胞通常对某些特定的应激因素表现出抗性[26,30-31]，本课题组在衰老模式生物酿酒酵母中发现多个短寿命酵母菌株，都表现出对氧化应激、DNA损伤等环境压力的敏感性，例如NAR1[32]、KSP1[33]、UBI4[34]、CIA2[35]、MET18[36]。目前研究认为，适当的应激反应可以诱导细胞产生相关的分子伴侣和保护性白蛋白，进而延长寿命；然而，过强的应激将加速细胞衰老(图1)。这种应激反应与寿命间的关系被定义为“毒物兴奋效应”[37]，目前研究较多的主要有内质网应激和氧化应激反应。

图1 细胞应激反应和衰老之间的关系

内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)是真核细胞的一种保护性应激反应, 细胞通过内质网应激可以降低内质网中堆积的未折叠蛋白及错误折叠蛋白。未折叠蛋白可以激活未折叠蛋白质反应(Unfolded protein response，UPR)，进而增强内质网对未折叠或错误折叠蛋白质的处理能力，减轻ERS压力，维持内质网的内环境稳态。但是，持续的内质网应激反应则会诱导细胞凋亡和死亡[38]。

哺乳动物细胞中有3条互相关联的UPR通路(IRE1、PERK和ATF6)共同参与调控内质网蛋白的动态平衡，而在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞中目前只发现由转录因子(Homologous to ATF/CREB 1，Hac1p)和ERS感应因子需肌醇酶1(Inositol Requiring Enzyme 1，Ire1p)共同介导的UPR信号通路，调控方式相对简单[38-39]。

研究报道，酿酒酵母缺失ALG12基因能延长细胞复制性寿命，其机制与细胞内上调的UPR通路活性相关[40]；本课题组也发现，缺失蛋白质-O-甘露糖转移酶1(Protein O-mannosyltransferase 1，PMT1)基因同样可以通过上调细胞内的UPR活性来延长酵母细胞的复制寿命[41]。

氧化应激是细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)生成能力与细胞的活性氧清除能力失衡所致，进而导致诸如DNA、蛋白质等生物大分子损伤的累积，这也是衰老“自由基学说”的核心内容[4]。

氧化应激和内质网应激一样，都像一把双刃剑，对细胞存在双重调控作用：适度的ROS可以作为第二信使激活多个转录因子，例如NF-κB、HIF-1α以及NRF2，进而调控细胞分化、细胞增殖与侵袭、血管生成[42-43]。但是，细胞内过量的ROS会诱发DNA突变，使DNA编码序列发生氧化损伤，从而使基因表达发生改变；还可通过改变DNA甲基化修饰影响基因的表达；此外，ROS还可使脂质氧化、蛋白质过氧化、分子交联等，最终导致细胞发生凋亡、衰老，甚至癌变。

细胞为了防御ROS对机体的氧化损伤，进化出一套完整的抗氧化系统。正常情况下，机体内ROS的产生和消除处于动态平衡状态。在衰老过程中，由于多种因素，细胞清除ROS的能力出现衰减的趋势，从而处于氧化应激状态。研究发现，氧化应激介导的细胞衰老途径主要包括DNA损伤通路[44]、NF-κB通路[45]和 p38MAPKs通路[46]。

细胞应激反应和衰老之间的相互调控关系一直都是衰老研究的热点，如何控制细胞应激反应的“度”，如何通过干预手段充分发挥细胞应激在衰老中的积极作用，都是目前亟待解决的关键问题，也是抗衰老药物研发的重要方向[47]。

3 能量代谢与衰老

能量代谢的改变与衰老进程以及衰老相关疾病的发生发展密不可分[48]。衰老细胞能量代谢的改变主要表现在线粒体功能的减弱及胰岛素/IGF-1(胰岛素/胰岛素样生长因子，Insulin/IGF-1)信号通路等能量代谢通路的改变。衰老细胞中线粒体功能减弱，表现为膜电位降低、质子泄漏增加、融合和分裂率降低、质量增加和三羧酸循环代谢物种类增加[49]。虽然衰老细胞中线粒体的数量可能逐渐增加，但其产生ATP的能力受到损害[50]。衰老动物包括人类中糖酵解增加，同时组织和血清中乳酸增加，表明衰老动物中有氧代谢减少，无氧代谢增加，ATP的生成效率明显下降[51]。衰老细胞线粒体的功能受到损伤，产生更多能引起蛋白质和脂质损伤的ROS，同时ROS还会导致端粒的缩短以及DNA损伤应答的活化[52]。Insulin /IGF-1信号通路是从酵母到哺乳动物及人类对长寿和衰老影响最大的通路之一[53]。抑制insulin /IGF-1通路后，可通过控制能量代谢延长酵母、线虫、果蝇和小鼠等模式生物的寿命[54-55]。这与能量限制(CR)可以通过激活AMPK通路、抑制TOR通路以及促进自噬延长寿命一致。因此，能量代谢通过线粒体功能减弱及胰岛素/IGF-1信号通路等能量代谢通路影响细胞衰老。

本课题组致力于糖异生过程的关键酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(PCK1)的研究，其广泛存在于肝脏、肾脏、白色和褐色脂肪组织中。PCK1的表达受两种不同的激素机制调控，包括肾上腺皮质分泌的皮质醇和胰岛A细胞分泌的胰高血糖素。胰高血糖素/胰岛素比值升高可诱导大量的PCK1生成，从而促进糖异生作用。因此，PCK1蛋白在调节并维持能量代谢尤其是糖代谢过程中发挥至关重要的作用。我们的研究结果表明，在酵母细胞中PCK1缺失可通过抑制糖异生产生和促进糖酵解产生更多乳酸等中间产物，从而诱导ROS的产生和6-磷酸果糖激酶1的表达产生，最终促进细胞衰老(待发表结果)。

4 衰老相关分泌表型

衰老细胞会分泌大量的细胞因子，这种现象称为衰老相关分泌表型(senescent associated secretory phenotype, SASP)，为叙述方便，本文将这些细胞因子统称为SASP因子。SASP因子种类繁多，包括促炎症细胞因子、趋化因子、生长因子和基质金属蛋白酶等(图2、表2)[56-57]。SASP因子介导了衰老细胞的许多生物学效应，其既是衰老细胞的标志，也可以通过自分泌和旁分泌的方式，加强和传播衰老[56,58]。SASP因子可以激活免疫系统，促进衰老细胞的清除[59-60]。SASP因子还参与伤口愈合、组织重塑等过程的调节[61-62]，但持续存在的SASP因子也会造成整体或局部的慢性炎症等，并可促进肿瘤生长[61]。本课题组的研究表明，在顺铂作用下，黑色素瘤通过发生衰老并分泌SASP因子，对抗顺铂的治疗作用，从而导致治疗失败；而用中和抗体对抗关键SASP因子(如IL-1a和IL-8)，可显著改善顺铂的治疗效果[64]。因此，SASP因子对机体的影响非常复杂，可能利大于弊，也可能相反，需根据具体情况进行分析。

衰老细胞的细胞周期停滞常与p16INK4A/RB或p53/p21通路激活有关，但这两条通路并不促进SASP的发生。调节SASP发生的信号通路主要包括NF-κB、 C/EBPβ(CCAAT/enhancer binding protein beta)、cGAS-STING(Cgmp-Amp synthase-stimulator of interferon genes)、GATA4(GATA Binding Protein 4)、 mTOR(Mammalian target of rapamycin)和 p38-MAPK等[64-68]。很多衰老诱导因子，如DNA损伤、胞浆染色质片段及损伤相关模式分子等，可通过调节这些信号通路而激活SASP[69-70]。

在不同衰老诱因、不同细胞类型及不同微环境下，产生的SASP因子种类和数量有很大的差异[71]。单细胞RNA测序结果进一步表明，不同细胞间SASP因子的表达量也存在明显差异[71]。造成细胞间异质性的原因之一在于，SASP是一个动态发展过程，IL-1α是SASP早期的分泌因子，其可促进多种SASP因子的产生[72]，而在后期，细胞可通过负反馈调节(如产生miRNA)，抑制SASP发展，从而降低其不利影响。

5 干细胞耗竭

干细胞耗竭可导致组织的再生功能下降，是机体衰老最明显的特征之一[1,73]。机体的造血功能随年龄增长而下降，对老年小鼠的研究显示，造血干细胞(HSCs)的细胞周期活性总体下降，同时老年HSCs的细胞分裂次数少于年轻HSCs[74]，这与DNA损伤积累[75]和 细胞周期抑制蛋白(如p16INK4a) 过度表达[76]相关。造血功能下降除可引起贫血和恶性肿瘤等疾病外，还可导致适应性免疫细胞生成减少，从而促进免疫衰老[77]。在几乎所有的成体干细胞区室中，均发现了相似的干细胞功能性耗竭，包括小鼠前脑、骨髓和骨骼肌[78-79]。端粒缩短是多种成体干细胞随年龄增长而衰退的重要原因[78-80]。目前，干细胞耗竭已成为抗衰老研究的重要靶点[1,73]。

图2 衰老细胞SASP因子的生物学功能[56]

表2 衰老相关分泌表型(SASP)成分[56]

6 免疫与衰老

免疫系统在衰老过程中出现明显变化，衰老过程中免疫参数的下降被称为免疫衰老。免疫衰老能引起促炎性因子的亚临床累积与炎性衰老，通常被认为是有害的。并且，免疫衰老与炎性衰老被认为是大多数老年人疾病的根源，如感染、癌症、自身免疫性疾病等[81]。但近年来的研究对免疫衰老的负面解释提出了挑战。

固有免疫系统在衰老过程中的主要特征是基础水平的免疫刺激以及当需要特定功能(如产生自由基)时的免疫麻痹[82]，这两方面都与炎性衰老密切相关。20年前，Franceschi等[83]提出炎性衰老的概念，认为衰老就是一种慢性、无菌、低度的炎症。炎性衰老状态是线粒体功能异常、自噬/吞噬功能缺陷、内质网应激、细胞碎片和错误定位的自身分子对炎症小体的激活、泛素/蛋白酶系统缺陷、DNA损伤反应的激活、衰老的T细胞及其SASP因子、年龄相关的肠道菌群的变化等综合产生的结果[84-86]。由于慢性低度的炎症，免疫细胞一直保持警惕状态，其必然结果就是固有免疫功能的下调或免疫麻痹，这也是固有免疫耐受的一种[82]。这种生理状态可以保护生物体免受进一步自我诱导的损害，即使是以损害病原体防御为代价。另外，自由基产生量低可以保护机体免受与衰老和氧化应激有关的进一步损害，趋化活性的降低在无菌发炎过程中可以防止过度的组织损伤，维持抗炎的M2型巨噬细胞所需的能量比维持促炎的M1型巨噬细胞要少很多[87]。因而，通过慢性炎症维持生理完整性而不是不惜一切代价消灭病原体，有可能是固有免疫系统在衰老过程中的适应性改变。另外，近年来发现的训练性固有免疫记忆也有可能导致固有免疫细胞处于持续激活状态[88]。Kleinnijenhuis等[89]发现，在卡介苗BCG刺激3个月后，单核细胞和巨噬细胞仍能够在不存在BCG的情况对其他任何刺激进行反应。这说明即使没有特定的刺激，训练过的免疫记忆也有可能导致持续的激活状态。因此，衰老过程中固有免疫系统的改变也不仅仅是由于衰老产生的。

适应性免疫系统在衰老过程中出现的特征性变化是初始型T细胞的减少和记忆性T细胞的增加[90]。其中初始型T细胞的减少是由胸腺退化、一生中急性和慢性抗原的刺激以及年龄相关的造血干细胞功能不全引起的，主要会导致TCR库减少，这是衰老中适应性免疫系统最基本的变化，被认为是老年人感染、癌症以及疫苗接种失败率升高的主要原因[91-93]。但新的研究对该观点提出质疑。首先，IL-7刺激初始型T细胞增殖能部分替代退化的胸腺，干细胞样记忆性T细胞也能参与补充T细胞[94]。其次，有研究表明具有更多的初始型CD8+T细胞并不代表具有更多的生存优势[95]。另外，胸腺退化也可能有一些进化上的原因，因为在整个机体趋于减少衰老过程中能量消耗的情况下，维持如此代谢活跃的器官是非常耗资源的，并且衰老的机体通常已经遇到了其居住区域大多数活跃的病原体。老年人因直接传染性原因死亡的概率并不高，说明衰老中对新型病原体反应能力下降的代价并不大，胸腺退化反而能节省能量消耗从而支撑其他生存所需的功能和活动。记忆性T细胞的数量的增加对于衰老的机体有可能是非常有益的。人体具有许多潜在的感染，可以在特定条件下不时重新激活，比如巨细胞病毒[96]。目前研究认为，巨细胞病毒感染的存在不仅仅有害，它维持的持续免疫警觉性有利于更好的免疫反应，其抗原的总体反应甚至与更好的存活率有关[97]。因此，同固有免疫系统类似，衰老过程中适应性免疫系统的变化不应被认为一定是有害的或者仅仅与衰老有关。

衰老过程中免疫细胞代谢功能受损近年来受到越来越多的关注。T细胞亚型的分化与所使用的特定代谢途径有关，并且有研究显示年轻人和老年人的T细胞代谢存在差异[98]。老年人的T细胞缺乏足够的底物来支持线粒体呼吸，因此能量缺乏，而没有分解的葡萄糖被转移到磷酸戊糖途径，促进了还原性因素(尤其是NADPH和还原型谷胱甘肽)的积累以及活性氧的清除[99]。能量缺乏的T细胞上调了能量传感器AMPK的激活，衰老T细胞中AMPK过度激活的下游靶标是DUSP4，DUSP4负调控MAPK超家族的成员ERK1、ERK2和JNK[100]。ERK是T细胞受体信号转导级联的关键调节因子，其被DUSP4去磷酸化后能削弱TCR诱导的信号并减弱T细胞功能。因此，在确定葡萄糖，氨基酸和脂质等外源营养物对免疫衰老的影响时需考虑衰老过程中其本身的变化。

衰老引起的免疫系统的修饰或调节不仅仅导致免疫系统的最终恶化，也使其更适应特定环境中的挑战。因此，Fulop等[101]提出免疫衰老是由于慢性侵略和时间造成的免疫适应与重塑，他们认为免疫系统中许多或大多数与年龄相关的变化可能是对衰老过程的理想适应，单一的免疫干预有可能造成潜在的长期伤害。免疫系统是一个庞大复杂的系统，并与中枢和周围神经系统、内分泌系统等相互影响。目前还需要进一步更广泛的研究提出新的免疫干预目标以减少衰老的有害影响，并利用有益的影响改善老年人的健康和功能。

7 展望

细胞衰老的发生发展是多因素参与、一系列基因协同调节的综合结果。在过去20年里，有关细胞衰老发生机制的研究已取得了较大进展，并提出多种衰老相关假说，揭示了多个衰老相关信号转导通路。近年来，本课题组致力于研究衰老发生机制，鉴定潜在的抗衰老靶标及抗衰老药物，取得了一定的进展。尽管如此，衰老与抗衰老是一个永恒的话题，衰老及衰老相关疾病发生机制依然有待深入研究。随着技术的革新和知识的扩充，越来越多的研究提示包括肠道菌群、RNA甲基化修饰等多种因素在衰老进程中也可能扮演至关重要的角色。本课题组将基于前期研究基础，结合多种新技术、新策略、新领域，继续深入探讨细胞衰老及衰老相关疾病的发生机制。