小果唐松草的化学成分及抑菌活性研究

蒋 捷，程 璐，马浩然，靳小琪，王富乾

华中科技大学同济医学院附属武汉市中西医结合医院药学部(湖北 武汉 430022)

小果唐松草(ThalictrummicrogynumLecoy.ex Oliv)俗称“飞蛾七”，是毛茛科(Ranunculaceae Juss)唐松草属(ThalictrumL.)的多年生草本植物，主要分布于我国的云南、山西、湖北、湖南等地[1]，具有抗肿瘤、抗寄生虫、抗血小板聚集、抗病毒、抗炎、抑菌等作用[2]，长期作为民族药用于治疗退热解表、跌打损伤、全身黄肿、眼睛发黄、祛寒等[3-4]。目前国内外对小果唐松草的化学成分研究极少，仅1篇文献对其化学成分进行了初步研究[1]。因此，为了补充其化学成分及药理活性研究的空缺，找到该植物的药效物质基础的有效成分，本研究对小果唐松草的根茎进行了化学成分及抑菌活性研究，现报道如下。

1 仪器与材料

1.1仪器Waters(2535/2998)半制备液相(美国Waters)，Waters SunFire TM半制备色谱柱(250 mm×10 mm，5 μm)，Bruker AM-400和Bruker Avance 600型核磁共振仪(德国Bruker)，AB SCIEX API 4000质谱仪RV 10旋转蒸发仪(德国艾卡)，EZ Plus中压色谱仪(利穗科技)，ZF-7型三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)，硅胶G254薄层板(烟台市化学工业研究所)，Sephadex TM LH-20凝胶(GE Healthcare Bio-Sciences AB)，色谱甲醇，色谱乙腈(Tedia)，提取用95%工业乙醇，其余试剂均为分析纯。

1.2植物来源与鉴定小果唐松草产于湖北神农架林区，由华中科技大学同济医学院张长弓教授鉴定为毛茛科唐松草属的草本植物小果唐松草。

2 提取与分离

将小果唐松草的根茎1.0 kg打粉后，室温下经95%乙醇浸泡提取3次，3 d/次，取提取液真空浓缩后，将所得浸膏用3 L蒸馏水混悬，置于分液漏斗中，用乙酸乙酯溶液进行多次萃取，旋干后得乙酸乙酯部位28.734 g。取乙酸乙酯部分在(200～300目)硅胶柱上进行分离，洗脱剂采用石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(30∶1→1∶1)，二氯甲烷-甲醇(20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1)梯度洗脱，得到11个组分Fr.1-Fr.11。

Fr.4经正相硅胶柱，石油醚-醋酸乙酯(10∶1→1∶1)洗脱得到Fr.4.1-Fr.4.7，Fr.4.3经SephadexLH-20凝胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脱得到Fr.4.3.1-Fr.4.3.5，Fr.4.3.1经SephadexLH-20凝胶柱色谱(甲醇)，分离得到Fr.4.3.1.1，Fr.4.3.1.2，Fr.4.3.1.2经反向中压色谱及制备HPLC后得化合物1(洗脱条件65%乙腈等度洗脱，保留时间25 min，5.87 mg)。Fr.4.3.4经SephadexLH-20凝胶柱色谱(甲醇)，分离得到Fr.4.3.4.1-Fr.4.3.4.4，Fr.4.3.4.2经半制备HPLC得化合物2(洗脱条件65%乙腈等度洗脱，保留时间21 min，7.97 mg)。Fr.4.2经SephadexLH-20凝胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脱得到Fr.4.2.1-Fr.4.2.5，其中4.2.3经半制备HPLC得到化合物3(洗脱条件62%乙腈等度洗脱，保留时间16 min，9.12 mg)。Fr.5经SephadexLH-20凝胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脱得到Fr.5.1-Fr.5.7，Fr.5.4经SephadexLH-20凝胶柱色谱(甲醇)分离得到Fr.5.4.1-Fr.5.4.4,，其中Fr.5.4.4经半制备HPLC得到化合物4(洗脱条件60%乙腈等度洗脱，保留时间19 min，7.83 mg)。Fr.5.1经SephadexLH-20凝胶柱色谱(甲醇)分离后得Fr.5.1.1-Fr.5.1.4，Fr.5.1.2经反相中压色谱后经半制备HPLC得化合物5(洗脱条件55%乙腈等度洗脱，保留时间23 min，9.40 mg)。Fr.10经SephadexLH-20凝胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脱得到Fr.10.1-Fr.10.3，Fr.10.2经SephadexLH-20凝胶柱色谱(甲醇)洗脱得到Fr.10.2.1-Fr.10.2.6，其中Fr.10.2.5重结晶得化合物6(甲醇中析出，9.00 mg)。Fr.8经SephadexLH-20凝胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脱得到Fr.8.1-Fr.8.4，Fr.8.1经反相中压色谱后得Fr.8.1.1-Fr.8.1.4，Fr.8.1.1经半制备HPLC得化合物7(洗脱条件35%乙腈等度洗脱，保留时间20 min，8.43 mg)。Fr.9经正相硅胶柱，二氯甲烷-甲醇(20:1→1:1)洗脱得到Fr.9.1-Fr.9.8，Fr.9.6经SephadexLH-20凝胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇1∶1)和SephadexLH-20凝胶柱色谱(甲醇)洗脱后得到Fr.9.6.1-Fr.9.6.7，Fr.9.6.7经半制备HPLC得到化合物8(洗脱条件15%乙腈等度洗脱，保留时间24 min，8.03 mg)。

表1 化合物1-8的分离流程

续表1：

化合物分离流程化合物7Fr.8凝胶(二氯甲烷-甲醇1∶1)→Fr.8.1.1HPLC(35%乙腈等度洗脱)→化合物7(8.43mg)化合物8Fr.9正相(二氯甲烷-甲醇20∶1→1∶1)→Fr.9.6凝胶(二氯甲烷-甲醇1∶1)→Fr.9.6.7HPLC(15%乙腈等度洗脱)→化合物8(8.03mg)

3 结构鉴定

化合物1：绿色油状固体(二氯甲烷)，ESI-MSm/z:279[M+H]+。经比较化合物1的波谱数据与文献[5]中报道基本一致，鉴定化合物1为n-butyl-isobutyl terephthalate，见表2。

表2 化合物1的碳谱(101 MHz)、氢谱(400 MHz)数据

注：—：表示该处无信号。

化合物2：无色柱状结晶(二氯甲烷)，mp 136～137℃，ESI-MS m/z:235[M+H]+，经比较化合物2的波谱数据与文献[6]报道基本一致，鉴定化合物2为缬草烯酸，见表3。

表3 化合物2的碳谱(101 MHz)、氢谱(400 MHz)数据

注：—：表示该处无信号。

化合物3：白色粉末(二氯甲烷)，mp 218～219℃，ESI-MS m/z:468 [M+H]+，经比较化合物3的波谱数据与文献[7]报道基本一致，鉴定化合物 3为乙酸蛇麻脂醇酯，见表4。

化合物4：黄色油状液体(二氯甲烷)，ESI-MS m/z:208 [M+H]+，经比较化合物4的波谱数据与与文献[8]报道基本一致，鉴定化合物 4为9,10-anthracenediones，见表5。

表4 化合物3的碳谱(101 MHz)、氢谱(400 MHz)数据

注：—：表示该处无信号。

表5 化合物4的碳谱(101 MHz)、氢谱(400 MHz)数据

注：—：表示该处无信号。

化合物5：无色粉末(二氯甲烷)，mp 57-59℃，ESI-MS m/z:427 [M+H]+，经比较化合物5的波谱数据与文献[9]报道基本一致，鉴定化合物5为stigmast-4-ene-3,6-dione，见表6。

表6 化合物5的碳谱(101 MHz)、氢谱(400 MHz)数据

续表6：

positionδCδHpositionδCδH834.31.90m2326.1—951.0—2445.9—1039.8—2529.21.66m1120.91.63,1.4 m2619.00.81d(6.5)1239.22.13,1.91m2719.80.83t(6.5)1342.6—2823.1—1456.6—2912.00.85t(7.0)1524.01.62m

注：—：表示该处无信号。

化合物6：无色片状晶体(二氯甲烷)，mp 170～172℃，ESI-MS m/z:413[M+H]+，经比较化合物6的波谱数据与文献[10]报道基本一致，鉴定化合物6为豆甾醇，见表7。

表7 化合物6的碳谱(101 MHz)、氢谱(400 MHz)数据

注：—：表示该处无信号。

化合物7：黄色油状固体(二氯甲烷)，mp 250～251 ℃，ESI-MS m/z:169[M+H]+，经比较化合物7的波谱数据与文献[11]报道基本一致，鉴定化合物7为2,6-二甲氧基苯醌，见表8。

表8 化合物7的碳谱(101 MHz)、氢谱(400 MHz)数据

注：—：表示该处无信号。

化合物8：黄色油状固体(甲醇)，ESI-MS m/z:126[M+H]+，经比较化合物8的波谱数据与文献[12]报道基本一致，鉴定化合物8为5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carboxaldehyde，见表9。

表9 化合物8的碳谱(101 MHz)、氢谱(400 MHz)数据

注：—：表示该处无信号。

4 化合物抑菌活性评价

采用微量倍比稀释法测定，测定化合物1～8对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。将化合物1-8用甲醇溶解后稀释为200 μg/mL作为受试药物。取无菌96 孔平底微量培养板，用移液枪每孔加入培养液100 μL;然后在第1行每孔依次加入受试药物100 μL，混匀后取出100 μL 移至第2 行中，依次进行倍比稀释直至第8 行混匀后弃掉100 μL，使稀释后各孔中的受试药物浓度倍比降低，最后每孔中加入106CFU·mL-1稀释菌悬液后于37℃培养箱中培养16 h后观察结果。结果显示：化合物2对绿脓假单胞菌MIC为100 μg/mL，对大肠杆菌MIC为50 μg/mL，化合物8对金黄色葡萄球菌MIC为50 μg/mL。

5 讨论

小果唐松草是我国常用的民族药材，虽然民族药的使用有其独特性，却缺乏系统、科学的资源评价模式，多数民族药没有确定的药效物质基础，因此导致药物的滥用及药物中的有毒成分对人体造成伤害，因此，对其进行化学成分研究，寻找该植物中的有效化学成分，确定其药效物质基础对其合理用药提供依据。本研究通过对其根茎提取物的乙酸乙酯部位进行了分离，得到了8个化合物，通过抑菌实验发现化合物2对绿脓假单胞菌MIC为100 μg/mL，对大肠杆菌MIC为50 μg/mL，化合物8对金黄色葡萄球菌MIC为50 μg/mL，本实验为小果唐松草的后续深入研究提供了一定的基础。