NUSAP1在肝癌中的表达及其对患者生存预后的影响

王宇航，肖 慧,郑冬雪，陆 进

1.蚌埠医学院(安徽 蚌埠 233030)2.蚌埠医学院人体解剖学教研室(安徽 蚌埠 233030)

肝癌的发病率和死亡率位居各种恶性肿瘤的前列，东亚是全球肝癌发病率和死亡率最高的地区[1]。据不完全统计，全球肝癌死亡人数中，我国约占50%[2]。慢性肝炎病毒、酒精、环境、机体免疫、遗传等多方面因素可导致肝癌[3]。随着对肝癌发病机制的深入研究发现[4]在癌变过程中涉及多种癌基因的异常表达，并且对肝癌患者的生存预后产生不利的影响。核仁纺缍体相关蛋白1(NUSAP1)在肝癌组织中的表达异常[5]，提示NUSAP1可能与肝癌的发生、发展和生存预后有关。研究肝癌的发病与影响生存预后因素的基因，并寻找出有效的治疗方法已逐步成为临床研究的重点。本研究综合利用多种在线分析数据库，分析NUSAP1在正常组织与肝癌组织中的表达差异，进而观察NUSAP1的表达与肝癌生存预后之间的关系，为临床提供进一步研究的方向，现报道如下。

1 资料与方法

1.1检索策略通过利用在线基因表达谱数据动态分析数据库(GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/)，检索年限从建库截至2009年6月，检索主题词：NUSAP1；卡普兰-迈尔-绘图仪(Kaplan-Meierplotter)数据库(http://kmplot.com/analysis/)，检索年限自建库截至2018年12月，检索主题词：NUSAP1；并利用肿瘤芯片数据库Oncomine(https://www.oncomine.org/)对NUSAP1基因在肝癌组织中的表达情况进行验证分析，最后再通过肿瘤免疫评估资源数据库(TIMER)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析NUSAP1在肝癌免疫微环境中与免疫细胞的关系及意义。

1.2方法

1.2.1 GEPIA数据库分析方法 分析NUSAP1在肝癌与正常组织中的表达差异：①“Expression DIY：BoxPlot”;②“Gene:NUSAP1”;③“Datasets Selecion:LIHC”;④“Matched Normal data：Match TCGA normal and GTEx data”;⑤“Expression DIY：Stage Plot”。

1.2.2 Kaplan-Meier Plotter数据库生存周期分析 Kaplan-Meier Plotter数据库筛选条件如下:①“癌症类型(Cancer):Liver cancer”;②“基因(Gene):NUSAP1”;③“生存(Survival):OS(overall survival，总体生存率)”;④“生存(Survival):RFS(recurrence-free survival，无复发生存期)”；⑤“生存(Survival):PFS(progression-free survival,无进展生存期)”;⑥“生存(Survival):DSS(disease-specific survival,疾病特异生存期)”。

1.2.3 Oncomine数据库分析条件 Oncomine数椐库限定条件：①“癌症类型(cancer type)：Liver cancer”；②“基因(gene)：NUSAP1”；③“数据类型(data type)：mRNA”；④“分析方法(analysis type)：癌症对正常(Cancer vs Normal analysis)”；⑤临界值设定条件：P<0.05，变化倍数(fold change)>1.5，基因排序(gene rank)：选择前10%(top10%)的数据，箱状图描述结果。

1.2.4 TIMER数据库分析条件 数椐库限定条件:①Gene:NUSAP1;②Cancer Type:Liver cancer;③Survival。

1.3统计学处理正常组织和肝癌组织中的NUSAP1表达比较采用t检验，不同肝癌分期中的NUSAP1表达比较采用单因素方差分析，采用Kaplan-Meier和Log-rank分析法对NUSAP1基因表达与生存预后进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1NUSAP1在肝癌和正常肝组织中的表达情况

NUSAP1在肝癌不同分期中均高表达，其中StageⅡ期高表达最明显，NUSAP1在肝癌不同分期中表达水平均高于正常肝组织(P<0.05)(图1)。

图1 NUSAP1在肝癌中的表达情况

2.2NUSAP1表达对患者生存预后的影响NUSAP1高表达组患者OS、RFS、PFS和DSS显著低于低表达组(P<0.05)(图2)。

图2 NUSAP1表达对肝癌患者生存预后的影响

2.3NUSAP1在各类肿瘤中的表达情况Oncomine数据库中共检索出388项与NUSAP1在不同类型肿瘤有关的研究结果，其中140项数据具有统计学意义，135项数据中NUSAP1表达增高，剩余5项表达降低。肝癌分类中有6项数据中的NUSAP1表达增高(P<0.05)(图3)。这6项研究囊括675个标本，分别发表于Mol Biol Cell(2002)[6]、Hepatology(2007)[7]和Cancer Res(2010)[8](表1)。通过对此6项研究进行Meta分析发现，其Median Rank=133.0，P-Vaule=3.66E-8，表明NUSAP1在肝癌组织的表达明显增高(P<0.05)(见图4，图5)。

图3 NUSAP1在各类肿瘤中的表达情况

表1 不同研究者肝癌芯片中NUSAP1的表达情况

图4 NUSAP1在Oncomine数据库不同肝癌研究芯片中的表达情况

图5 NUSAP1在肝癌研究数据中的Meta分析

2.4NUSAP1在肝癌免疫微环境中的表达情况分析结果显示，NUSAP1在肝癌免疫微环境中与肿瘤细胞纯度、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞呈正相关(P<0.05)(图6)，肝癌患者的累积存活率不受免疫细胞的影响(P>0.05)，NUSAP1高表达对生存预后有不利的影响(P<0.05)(图7)。

图6 NUSAP1在免疫微环境中的表达情况

图7 免疫细胞的表达与患者生存预后的关系

3 讨论

肝癌的恶性程度高，目前尚缺乏有效治愈手段，随着分子生物学的不断发展，一些与肝癌发生有关的基因如ASPM[9]、NCAPG[10]、CDC20[11]、NUSAP1[12]等相继被发现，通过研究这些基因与肝癌发病之间的关系，可进一步研发出靶向治疗药物，以达到精准治疗肝癌的目的，改善患者预后并延长患者生存时间。

NUSAP1属于微管结合蛋白，其主要在纺锤体组装中起作用，是一种可以保持细胞周期正常进行的调控分子[13]，研究发现[14-15]NUSAP1表达量增高或与肿瘤的复发和转移有关，在结肠癌、肾细胞癌以及肝癌中高表达。本次研究结果显示NUSAP1在肝癌患者中高表达，在不同肝癌分期中的表达量均增高，且在StageⅢ中表达量最高。据此可推断NUSAP1受到某些遗传或外界因素的影响时表达量增高使细胞周期发生异常，从而诱导组织癌变，促进肝癌的发生。通过Kaplan-Meier Plotter数据库进行生存分析发现NUSAP1表达量增高对肝癌患者的预后有显著影响(P<0.05),当其高表达时，患者OS、RFS、PFS和DSS均显著低于低表达组(P<0.05),据此推测NUSAP1表达量增高可促进细胞分裂，加速肝癌组织的发生发展，不利于患者的预后。通过分析Oncomine数据库中关于NUSAP1在正常组织与癌旁组织间的表达情况，388项研究中共有140项研究有统计学差异，其中135项研究的NUSAP1高表达，剩余5项研究为低表达。进一步分析其在肝癌组织中的研究结果，发现在Chen Liver[6]、Wurmbach Liver[7]、 Roessler Liver[8]等的研究芯片中，NUSAP1在肝细胞癌、肝脏局灶性结节增生和肝细胞腺癌中的表达量均高于正常组织(P<0.05)，表明NUSAP1对癌症发生的影响范围广泛，可以影响多种肝脏组织的癌变。而在肝癌免疫微环境的分析说明NUSAP1虽然在一定程度上激活患者机体的免疫反应，但这种防御程度不足以发挥抗肿瘤的作用，对肝癌患者的生存预后无明显影响。NUSAP1与肝癌组织关系密切，其对正常组织的多方向癌变以及患者预后均有影响，可以据此为临床上提供进一步的研究方向，探究关于NUSAP1的靶向治疗方案以更好的治疗肝癌。

本次研究使用了几种样本量大、数据可靠的数据库，所用数据来源于基因芯片，可以大幅降低误差，提高研究结果的可信度。所得出的结果与张猛等[16]在临床实例中得出的结论相一致，均为NUSAP1在正常组织中低表达，在肝癌组织中高表达，且对肝癌患者的预后有显著影响。但客观分析本次数据，其研究时间处于2002年到2009年之间，数据更新不够及时，不能够全面反映肝癌最近的变化趋势，有待于进一步研究。

本次研究利用各种数据库对NUSAP1在不同组织中的表达情况进行数据挖掘与分析，减小了单独调查所导致的样本误差，不仅使结论更加可靠，而且降低了科研成本。综上所述，本次研究结果表明NUSAP1在肝癌组织中高表达且对肝癌预后有显著影响，可据此为临床使用靶向药物治疗肝癌提供新的治疗方案。