华中五味子中一个新的糖苷类化合物及活性研究

季嘉诚，邱 峰，雷新响

中南民族大学药学院，武汉 430074

华中五味子(SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.)为木兰科(Magnoliaceae)五味子属(Schisandra)植物，主要产于湖北、湖南、四川、贵州、云南东北部等地区，生于海拔600-3000米的湿润山坡边或灌丛中[1]。根据现代研究表明，华中五味子具有中枢神经系统镇静、PAF拮抗、延缓衰老、清除自由基、抑制过氧化脂质形成、抗炎、抗HIV等药理作用[2]。其中，任荣从华中五味子中分离得到的methylgomisin O和schisantherin A具有抗炎活性作用[3]；Gao等[4]人从华中五味子中分离得到的anwulignan具有较好的肝保护作用；Liu等[5]从华中五味子中分离得到的schisphenthin A等三萜类化合物具有抗增殖作用，分离得到的schisphenlignan L等木脂素类化合物具有神经保护作用。

因此，华中五味子中仍具有待发现、活性较好的成分。鉴于华中五味子果实的研究较多，本实验选取华中五味子藤茎，对其化学成分和活性进行了较为系统的研究。从中分离了得到7个化合物，通过波谱学数据鉴定了其化学结构，分别为：6′′-O-对羟基苯甲酰红景天苷(1)、nectandrin B(2)、7-(3,4-dimethoxyphenyl)-7′(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-8,8′(dimethylbutyl) acetate(3)、henricine B(4)、(8R,8′R)-3,4-dimethoxy-3′,4′-methylenedioxy-7,7′-dioxo-8,8′-neolignan(5)、secoisolariciresinol(6)、calceolarioside B(7)。化合物1为新化合物，化合物1、6、7具有较好的NO释放的抑制作用。

1 仪器与材料

Bruker AM-600型核磁共振光谱仪(德国Bruker公司)；Agilent 1260Ⅱ型HPLC(Agilent公司)，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6×250 mm)，粒径5 μm；半制备柱Venusil XBP C18柱(10×250 mm)，粒径5 μm；TBP-5010型中压柱(上海同田生物技术股份有限公司)；柱色谱硅胶(200～300目，青岛海洋化工厂)；薄层硅胶板(青岛海洋化工厂)；95%乙醇(武汉兴和达商贸有限公司)；反相硅胶 Chromatores(日本Fuji公司)；石油醚(化学纯，上海泰坦化学有限公司)；乙酸乙酯(化学纯，上海泰坦化学有限公司)；甲醇(化学纯，上海泰坦化学有限公司)；色谱甲醇(SIGMA公司)；色谱乙腈(成都科隆化学品有限公司)。

小鼠单核巨噬细胞 RAW264.7， 购自中科院细胞库；吲哚美辛(阿拉丁公司)；NO检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；LPS(上海源叶生物科技有限公司)。

华中五味子由中南民族大学药学院杨光忠教授鉴定为华中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的藤茎。

2 提取与分离

将华中五味子藤茎晒干，粉碎后称重，得10 kg。随后用25升95%乙醇在室温下渗漉提取3次，每次4天。将提取液进行抽滤，除去药渣，在进行浓缩，得浸膏。浸膏用乙酸乙酯进行萃取，萃取三次。将萃取液减压浓缩后得乙酸乙酯部位168 g。用300 g正相柱硅胶(200～300目)拌样，3 000 g正相柱硅胶(200～300目)湿法装柱，采用干法上样，进行柱层析。用石油醚-乙酸乙酯体系(体积比15∶1→0∶1)进行梯度洗脱，根据TLC检测后的色谱行为相似性，得6个组段，编号为Fr.A～F。将Fr.B用反相硅胶柱层析分离，得8个组分：Fr.B-1～B-8。将Fr.C用反相硅胶柱层析分离，得4个组分：Fr.C-1～C-4。取Fr.C-2(39.0 mg)进行半制备型HPLC纯化(甲醇：水=55∶45，3 mL/min)，得化合物5(2.0 mg，tR=6.9 min)。取Fr.C-3(123.6 mg)进行半制备型HPLC纯化(甲醇∶水=60∶40，3 mL/min)，得化合物2(7.7 mg，tR=33.0 min)和化合物3(3.2 mg，tR=40.8 min)。将Fr.D用反相硅胶柱层析分离，得10个组分：Fr.D-1～D-10。取Fr.D-5(113.8 mg)进行半制备型HPLC纯化(乙腈∶水=40∶

60，3 mL/min)，得化合物4(14.4 mg，tR=33.0 min)。将Fr.F用反相硅胶柱层析分离，得11个组分：F-1～F-11。取Fr.F-5(204.9 mg)进行半制备型HPLC纯化(乙腈∶水=15∶85，3 mL/min)，得化合物1(2.1 mg，tR=23.3 min)。取Fr.F-7(137.6 mg)进行半制备型HPLC纯化(乙腈∶水=19∶81，3 mL/min)，得化合物7(9.6 mg，tR=18.5 min)。取Fr.F-8(151.8 mg)进行半制备型HPLC纯化(乙腈∶水=23.5∶76.5，3 mL/min)，得化合物6(7.5 mg，tR=18.7 min)。

3 结构鉴定

化合物1黄色粉末状物质， -50°(c0.02，MeOH)，HR-ESI-MS谱给出的准分子离子峰m/z443.131 1[M + Na]+(计算：443.131 8)，故确定分子式为C21H24O9，不饱和度为10。结构见图1。

图1 化合物1的结构式Fig.1 The chemical structure of compound 1

表1 化合物1的1H和13C谱数据

续表1(Continued Tab.1)

PositionδH(J in Hz)δC3.90,m1''4.31,d,7.8104.62''3.22,m75.13''3.39,m784''3.39,m725''3.58,m75.56''4.41,dd,11.8,6.364.94.59,dd,11.8,2.1

化合物1的1H NMR谱和13C NMR谱(Table 1)中显示两个典型的苯环对位双取代系统[δH6.66(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.80(2H，d，J=8.8 Hz，H-3，5)，6.98(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，7.85(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)]，一个葡萄糖信号[ 4.31(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′′)，3.22(1H，m，H-2′′)，3.39(1H，m，H-3′′)，3.39(1H，m，H-4′′)，3.58(1H，m，H-5′′)，4.41(1H，dd，J=6.3，11.8 Hz，H-6a′′)，4.59(1H，dd，J=2.1，11.8 Hz，H-6b′′)]，一个亚甲基信号[2.81(2H，m，H-7′)]，一个含氧亚甲基信号[3.70，3.91(2H，m，H-8′)]和一个酯基信号(δC168.05)。因此，基本可以推出该化合物的平面结构。此化合物1的详细结构鉴定数据原始图谱可以从本刊官网免费下载(www.trcw.ac.cn)。

在HMBC谱可以看出(图2)，H-3′(δH6.98)与C-7′(δC36.54)存在相关，H-8′(δH3.70，3.91)与C-7′(δC36.54)存在相关，H-1′′(δH4.31)与C-8′(δC72.44)存在相关，H-2(δH7.85)与C-7(δC168.05)存在相关以及H-6′′(δH4.41，4.60)与C-7(δC168.05)存在相关，可以推出乙氧基连在C-4′(δC130.57)上，葡萄糖连的位置在C-8′上，对羟基苯甲酸通过酯化反应连在糖的6′′位上。因此，可以确认化合物1的平面结构，如图1所示。

由于葡萄糖的端基氢的耦合常数为7.8 Hz，因此可以推出糖苷键为β构型，通过文献调研，可以发现化合物1与6′′-O-galloyl salidroside[6]非常相似，它们之间差别就是化合物1少了3、5位的羟基。通过文献查阅还可以发现化合物1应该是红景天苷[7]跟对羟基苯甲酸酯化形成，故推断出化合物1的葡萄糖为β-D型。因此，化合物1为6′′-O-对羟基苯甲酰红景天苷。

图2 化合物1的关键HMBC相关Fig.2 The key HMBC correlations of compound 1

化合物2黄色油状;1H NMR(CDCl3，600MHz)δH：1.03(6H，d，J=6.6 Hz，3-Me，4-Me)，2.32(2H，m，H-3，H-4)，3.88(6H，s，3′-OMe，3′′-OMe)，4.49(2H，d，J=6.6 Hz，H-2，H-5)，5.62(2H，s，4′-OH，4′′-OH)，6.91(2H，s，H-2′，H-2′′)，6.92(2H，d，J=1.7 Hz，H-5′，H-5′′)，6.95(2H，d，J=1.7 Hz，H-6′，H-6′′)；13C NMR(CDCl3，150 MHz)δC：13.0(3-Me，4-Me)，44.3(C-3，C-4)，55.9(3′-OMe，3′′-OMe)，87.3(C-2，C-5)，109.1(C-2′，C-2′′)，114.1(C-5′，C-5′′)，119.3(C-6′，C-6′′)，134.2(C-1′，C-1′′)，145.0(C-4′，C-4′′)，146.4(C-3′，C-3′′)。以上波谱数据与文献[8]报道对照基本一致，故鉴定化合物为nectandrin B。

化合物3微黄油状；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：0.78(3H，d，J=6.8 Hz，H-9′)，1.02(3H，d，J=6.8 Hz，H-9)，1.79(1H，m，H-8)，2.03(3H，s，H-11)，2.42(1H，m，H-8′)，3.68(1H，d，J=11.2 Hz，H-7′)，3.80(3H，s，4-OMe)，3.82(1H，overlap，H-7)，3.82(3H，s，3-OMe)，3.85(3H，s，3′-OMe)，4.16(1H，dd，J=10.8，4.8 Hz，H-7)，6.73(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.81(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6′)，6.86(1H，d，J=8.3 Hz，H-5)，6.90(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.91(1H，dd，J=8.3，2.0 Hz，H-6)，6.92(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：13.5(C-9′)，17.1(C-9)，21.0(C-11)，34.4(C-8)，40.3(C-8′)，56.5(C-7′)，56.5(3′-OMe)，56.5(3-OMe)，57.3(4-OMe)，67.2(C-7)，112.8(C-2′)，112.8(C-2)，113.0(C-5′)，116.3(C-5)，121.2(C-6′)，121.2(C-6)，137.6(C-1′)，139.7(C-1)，145.6(C-4′)，148.6(C-4)，148.9(C-3′)，150.2(C-3)，173.3(C-10)。以上波谱数据与文献[9]报道对照基本一致，故鉴定化合物为7-(3,4-dimethoxyphenyl)-7′(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-8,8′(dimethylbutyl)acetate。

化合物4白色粉末;1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：0.75(3H，d，J=7.0 Hz，H-9′)，0.98(3H，d，J=7.0 Hz，H-9)，1.89(1H，m，H-8)，2.02(3H，s，H-11)，2.36(1H，m，H-8′)，3.62(1H，d，J=11.73 Hz，H-7′)，3.80(1H，d，J=11.2 Hz，H-7)，3.82(3H，brs，H-12)，3.82(3H，brs，H-13)，4.12(1H，dd，J=10.9，5.1 Hz，H-7)，6.71(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.73(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.76(1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6′)，6.78(1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6)，6.85(1H，d，J=1.6 Hz，H-2′)，6.87(1H，d，J=1.6 Hz，H-2)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：13.5(C-9′)，17.1(C-9)，21.0(C-11)，34.3(C-8)，41.9(C-8′)，56.5(C-12)，56.5(C-13)，57.2(C-7′)，67.4(C-7)，112.6(C-2′)，112.8(C-2)，116.1(C-5′)，116.3(C-5)，121.1(C-6′)，121.2(C-6)，138.0(C-1′)，138.4(C-1)，145.3(C-4′)，145.3(C-4)，148.8(C-3′)，148.8(C-3)，173.8(C-10)。以上波谱数据与文献[10]报道对照基本一致，故鉴定化合物为henricine B。

化合物5微黄油状；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：2.14(3H，brs，H-9)，2.15(3H，brs，H-9′)，3.78(3H，s，3′-OMe)，3.87(1H，m，H-8′)，3.89(3H，s，4′-OMe)，3.95(1H，d，J=14.8 Hz，H-8)，6.02(2H，s，OCH2O)，6.78(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，6.91(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.92(1H，d，J=1.6 Hz，H-2′)，7.05(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.23(1H，dd，J=8.2，1.6 Hz，H-6′)，7.28(1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：15.9(C-9′)，16.0(C-9)，48.2(C-8′)，48.4(C-8)，54.9(3′-OMe)，55.1(4′-OMe)，102.1(OCH2O)，107.2(C-5′)，107.6(C-5)，109.9(C-2′)，110.7(C-2)，124.8(C-6)，126.4(C-6′)，129.7(C-1)，131.5(C-1′)， 148.1(C-3′)，148.9(C-3)，152.2(C-4′)，153.8(C-4)，197.8(C-7′)，198.3(C-7)。以上波谱数据与文献[11]报道对照基本一致，故鉴定化合物为(8R,8′R)-3,4-Dimethoxy-3′,4′-methylenedioxy-7,7′-dioxo-8,8′-neolignan。

化合物6红色油状；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：1.90(2H，m，H-8，H-8′)，2.57(2H，m，H-7a，H-7a′)，2.64(2H，m，H-7b，H-7b′)，3.58(4H，m，H-9，H-9′)，3.73(6H，s，3-OMe，3′-OMe)，6.53(2H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6，H-6′)，6.58(2H，d，J=1.8 Hz，H-2，H-2′)，6.65(2H，d，J=8.0 Hz，H-5，H-5′)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：34.6(C-7，C-7′)，42.6(C-8，C-8′)，54.7(3-OMe，3′-OMe)，60.7(C-9，C-9′)，111.6(C-2，C-2′)，114.3(C-5，C-5′)，121.3(C-6，C-6′)，132.4(C-1，C-1′)，144.0(C-4，C-4′)，147.4(C-3，C-3′)。以上波谱数据与文献[12]报道对照基本一致，故鉴定化合物为secoisolariciresinol。

化合物7褐色油状；1H NMR(CD3OD，600 MHz)δH：2.80(2H，m，H-β′)，3.23(1H，t，J=8.2 Hz，H-2′)，3.39(2H，m，H-3′，H-4′)，3.54(1H，m，H-5′)，3.72(1H，dd，J=16.9，8.1 Hz，H-α)，3.97(1H，dd，J=16.7，8.0 Hz，H-α)，4.34(2H，m，H-1′，H-6′)，4.51(1H，dd，J=11.8，1.8 Hz，H-6′)，6.30(1H，d，J=15.8 Hz，H-α′′)，6.55(1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6)，6.65(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.69(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′′)，6.90(1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6′′)，7.05(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′′)，7.58(1H，dd，J=15.8，2.0 Hz，H-β′′)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δC：35.3(C-β)，63.2(C-6′)，70.3(C-4′)，71.0(C-α)，73.6(C-2′)，74.0(C-5′)，76.5(C-3′)，103.1(C-1′)，113.4(C-α′′)，113.6(C-2′′)，114.9(C-5)，115.1(C-5′′)，115.7(C-2)，119.8(C-6)，121.8(C-6′′)，126.2(C-1′′)，129.9(C-1)，143.2(C-4)，144.7(C-3)，145.4(C-β′′)，145.9(C-3′′)，148.2(C-4′′)，167.8(C=O)。以上波谱数据与文献[13]报道对照基本一致，故鉴定化合物为calceolarioside B。

4 化合物抗炎活性研究

细胞培养参照文献[14]的操作步骤，在CO2浓度为5%，温度为37 ℃的恒温培养箱中培养含有RAW 264.7巨噬细胞的培养基，隔天传代，备用。衡量NO水平的指标为Griess法测定样品中的NO2-/NO3-。取RAW 264.7单细胞悬液，接种于96孔培养板(200 μL /孔)中，细胞数为1×104/孔。在37 ℃条件下培养24 h后，将100 μL 阳性药(吲哚美辛)或受试化合物溶液加入到每个孔中，并设置5个复孔。在30 min后每孔加入100 μl的LPS(终浓度5 μg/mL)。然后置于37 ℃培养24 h，吸取培养液上清50 μL加入到酶标板中，加入50 μL Griess I试剂，再加入50 μL Griess II试剂，540 nm处测定吸光值。抑制率I的计算公式为:

化合物对LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞释放NO的抑制率见表2，可以看出吲哚美辛的抑制率为49.43%，化合物1、6、7的抑制率均比吲哚美辛的抑制率高，由此说明化合物1、6、7具有较好的NO释放的抑制作用。这为今后探寻华中五味子抗炎活性成分提供了一些科学依据。

表2 化合物对LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞释放NO的抑制率

5 讨论

目前，对于华中五味子的研究主要为果实，关于其藤茎的化学成分研究报道较少[15]。本实验从华中五味子藤茎的95%乙醇提取物的乙酸乙酯部位分离、鉴定了7个化合物，化合物1为糖苷类化合物，化合物2～7均为木脂素类化合物，且化合物1为新化合物。此外对这些化合物进行了抗炎活性研究，研究表明化合物1、6、7在50 μmol/L的浓度下，对小鼠RAW264.7巨噬细胞的NO生成抑制率均比吲哚美辛的抑制率高，说明化合物1、6、7具有较好的NO释放的抑制作用，这对木脂素类和糖苷类化合物的生物活性研究具有一定的价值和意义。炎症是人类疾病中最常见的病理过程，大多数疾病均与此有关[16]。根据华中五味子的应用和价值，其抗炎活性及其作用机制值得进一步研究。本研究不仅丰富了华中五味子的化学成分及药理活性研究，还为其木脂素成分、糖苷类成分的抗炎活性提供了实验依据，并对华中五味子进一步的开发与利用提供了理论基础。