核桃内生真菌抗氧化菌株的筛选及其代谢产物活性研究

庞俊倩，赵鑫丹，郝苑汝，高 飞，翟梅枝

西北农林科技大学林学院核桃研究中心，杨凌 712100

由于食品、医药等工业的需求，从自然界中寻找天然的、安全的抗氧化剂受到越来越多的关注，植物资源是目前天然抗氧化剂的主要来源。内生真菌是生活在植物组织内，但不对宿主造成明显病害症状的腐生、寄生、共生真菌及细菌等微生物[1]。有研究表明，内生真菌普遍存在于植物组织当中，它们能够产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质,许多活性成分被证明具有明显的抗癌、抗菌、抗氧化等活性[2]，是获得抗菌、抗氧化药物先导化合物的重要来源。植物内生菌中得到的天然抗氧化剂结构新颖，活性显著，为天然抗氧化活性物质提供了又一丰富的资源。

核桃(JuglansregiaL.)是胡桃科核桃属落叶乔木，在我国栽培历史悠久，分布广泛，资源丰富[3]。核桃各组织本身具有抗氧化活性，Zhang等[4]发现核桃青皮提取物不同溶剂的提取相具有不同程度的抗氧化作用，Wei等[5]研究了核桃叶提取物及其各萃取部分的抗氧化活性，结果表明核桃叶75%乙醇提取物对DPPH·及ABTS+·IC50均低于VC。这些研究表明，核桃不同组织提取物具有较高的抗氧化活性。根据宿主共生理论，内生真菌可以产生与宿主植物相同或相似的化合物，在核桃内生真菌中是否同样存在高活性抗氧化物质亟待研究。目前，对于核桃内生真菌的研究多集中在多样性和抗菌方面方面[6,7]，对抗氧化活性的研究报道较少，本研究以期为核桃内生真菌高抗氧化菌株作为天然抗氧化剂的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 材料

供试29株核桃内生真菌，均由本实验室从宜君、蓝田两地采集不同核桃组织中分离得到，经纯化后现保存于西北农林科技大学核桃研究中心实验室。菌种编号、分离部位、采样季节以及菌株归属见表1。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)，用于内生真菌的活化培养；马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)，用于内生真菌的发酵培养。

1.1.3 主要试剂及仪器

主要试剂：VC(上海源叶生物科技有限公司，纯度≥99%)；芦丁(上海源叶生物科技有限公司，纯度≥99%)；没食子酸(上海源叶生物科技有限公司，纯度≥99%)；二苯代苦味肼基自由基(DPPH·，纯度>97%，东京化成工业株式会社)；2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；试剂均为分析纯。

主要仪器：UV-1200 紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；RE-52AA 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器有限公司)；SKY-2102C型恒温震荡培养箱(上海苏坤实业有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

将4 ℃保存的内生真菌接种于PDA平面固体培养基上，在28±1 ℃下培养4～6天，待菌落长至直径40～50 mm，保存用于液体发酵。

1.2.2 内生真菌的发酵

在无菌条件下用直径为6 mm的打孔器在活化好的内生真菌菌落外缘打取菌饼，用接种针接种至含300 mL马铃薯葡萄糖液体培养基500 mL锥形瓶中，在28±1 ℃、180 rpm摇床上震荡培养7天。

1.2.3 发酵产物及不同溶剂抗氧化样液的制备

发酵产物样品液制备：发酵液经双层滤纸过滤，在60～65 ℃、70 rpm的条件下，减压浓缩至浸膏状，配成1 mg/mL的样品溶液，备用。

高活性菌株萃取液制备：高活性菌株大量发酵(方法同1.2.2)，发酵液减压浓缩至原体积的1/10，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每种溶剂萃取三次，减压浓缩成浸膏状，依次得到石油醚提取物(PEE)、乙酸乙酯提取物(EAE)、正丁醇提取物(BAE)及萃余物(WTE)，备用。

1.2.4 DPPH·自由基清除率测定

参照Tan等[8]的方法稍作修改，取2 mL DPPH·(0.1 mmol/L)乙醇溶液，加入2 mL 1 mg/mL样品溶液，摇匀，室温避光下静置30 min，在波长517 nm处测定吸光值。试验设置3组平行，结果取平均值，并以VC为阳性对照。

1.2.5 总还原力测定

总还原力采用FRAP法，TPTZ工作液配制参考Kaushik等[9]的方法。用VC作标样，绘制标准曲线，如图1。

图1 Vc标准曲线Fig.1 Standard curve of Vc

1.2.6 总酚、总黄酮含量的测定

总酚含量测定釆用福林酚法，参照Rosana等[10]的方法。用没食子酸作标样，绘制标准曲线，如图2(a)。黄酮含量的测定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[11]，用芦丁作标样，绘制标准曲线，如图2(b)。

1.2.7 数据分析

2 结果与分析

2.1 抗氧化活性菌株的筛选

2.1.1 供试29株核桃内生真菌的发酵产物对DPPH·的清除作用

29株内生真菌的发酵产物对DPPH·清除率结果见表1。

图2 没食子酸(a)、芦丁(b)标准曲线Fig.2 Standard curve of gallic acid(a) and rutin(b)

表1 29株核桃内生真菌的发酵产物对DPPH·清除率

续表1(Continued Tab.1)

编号Strain No.季节Season组织Part (tissue) of the plant属GenusDPPH·清除率DPPH· scavenging rate(%)LTL-6-6夏Summer交链孢霉属Alternaria11.63±2.01LTS-6-6夏Summer须壳孢属Pyrenochaeta96.47±0.99LTS-6-4夏Summer黑葱花霉属Periconia44.38±0.01LTS-6-1夏Summer交链孢霉属Alternaria52.60±1.58LTL-6-5夏Summer小卵孢霉属Ovularia26.36±0.88

注：供试浓度：1 mg/mL。

Note:Test concentration:1 mg/mL.

由表1可见，供试29株核桃内生真菌的发酵产物均具有一定的抗氧化活性，但抗氧化活性各不相同。在供试浓度1 mg/mL时，样品LTS-6-6抗氧化活性能力最强，对DPPH·自由基的清除率为96.47%±0.99%；样品YJL-3-5、YJL-5-3、YJL-2-4、LTS-3-1、YJL-2-5、LTL-3-1、LTL-5-4和LTS-6-1也显示了较强的抗氧能力，对DPPH·的清除率均超过50%，其他20个样品对DPPH·清除率都小于50%，尤其菌株LTS-2-1、LTL-2-2、YJS-5-2的发酵产物的抗氧化能力最弱，DPPH·清除率都小于10%。鉴于此，将对DPPH·清除率超过50%的9株真菌作为活性菌株，进一步考察它们的总还原力。

9株内生真菌发酵产物对DPPH·清除率大于50%的活性菌株。测试样品对DPPH·呈现出了不同程度的清除作用，从分离部位看，一年生茎2株、两年生茎3株、叶2株和果2株。由此可看出，活性菌株主要来自于当年生或两年生组织中。从归属来看，5株属于花核菌属，即：YJL-2-4、YJL-2-5、YJL-3-5、LTL-3-1、LTS-3-1。在浓度为1 mg/mL时，这5株内生真菌的发酵产物对DPPH·清除率在56.33%～77.16%；2株归属为交链孢霉属，清除率在52.60%～56.84%；另外1株来自于派伦霉属，清除率78.28%；一株来自于须壳孢属，清除率为96.47%。从分离地点看，来自宜君的4株，来自蓝田的5株。综合分析认为，核桃内生真菌中花核菌属、交链孢霉属与其他菌属相比，发酵产物具有较好的抗氧化活性。

2.1.2 较强活性菌株总还原力比较

抗氧化物质的抗氧化活性与其还原力存在着直接的联系。亚铁还原能力测定是评价物质抗氧化能力的一种通用的方法，通常物质的还原能力越强，抗氧化能力就越强[12]。对9株DPPH·清除率超过

50%的菌株发酵产物进行总还原力测定。结果如图3所示。

图3 活性菌株的总还原力 Fig.3 The total antioxidant capacity of 9 active strains of better DPPH· radical注：A，B，C，D代表显著性差异，P<0.01。Note:A,B,C,D represent significant differences compared with each other,P<0.01.

由图3可见，供试9株活性菌株的总还原力依次为：LTS-6-6>YJL-5-3>LTL-3-1>YJL-2-5>LTL-5-4>YJL-3-5>LTS-6-1>LTS-3-1>YJL-2-4。其中，菌株LTS-6-6的总还原力为130.47 mg VC/g，显著高于其他菌株；其余8株内生真菌的总还原力均在15 mg VC/g以下，总还原力最低的是YJL-2-4，仅为9.54 mg VC/g。故选择LTS-6-6作为抗氧化高活性菌株进行下一步研究。

2.2 高活性菌株LTS-6-6不同部位萃取物的抗氧化活性评价

2.2.1 高活性菌株LTS-6-6不同萃取物的总酚、总黄酮含量及总还原力

对高活性菌株LTS-6-6各萃取物的总还原力和总酚、总黄酮含量进行测定，结果如表2和图4所示。

表2 LTS-6-6不同部位萃取物的总酚、总黄酮含量及总还原力

注：A、B、C、D代表显著性差异，同一指标相互比较，P<0.01。

Note:A,B,C,D represent significant differences.Compared with each other in dependence of the same index,P<0.01.

图4 LTS-6-6不同部位萃取物的总酚、总黄酮含量及总还原力Fig.4 Total phenol content,total flavonoid and total antioxidant capacity of different extracts from LTS-6-6注：A，B，C，D代表显著性差异，同一指标相互比较，P<0.01。Note:A,B,C,D represent significant differences.Compared with each other in dependence of the same index,P<0.01.

由表2和图4可知，就总还原力而言，EAE的总还原力最高，为527.59±10.66 mg VC/g，显著高于其它溶剂提取物；BAE总还原力居中，为149.08±3.62 mg VC/g；WTE和PEE总还原力最低，分别为60.60±1.28和66.48±0.21 mg VC/g，仅为EAE的1/9、1/8。就总酚含量而言，EAE的含量最高，为641.14±7.50 mg 没食子酸/g；WTE总酚含量最低，为38.91±0.54 mg 没食子酸/g。不同溶剂提取物总酚含量之间差异显著，EAE的总酚含量分别为PEE、BAE、WTE的4倍、7倍、16倍。就总黄酮而言，EAE的总黄酮含量最高，为100.30±8.44 mg/g，分别为PEE、BAE、WTE的3倍、6倍、9倍。

众多研究[13,14]表明，黄酮类和多酚类物质是天然抗氧化剂的主要物质基础。在对高活性菌株发酵产物的各萃取物总酚、总黄酮、总还原力测定的基础上，分析总酚、总黄酮含量和总还原力的相关性，总还原力与总酚、总黄酮含量呈正相关性，相关系数分别为0.8771、0.9177。萃取后，乙酸乙酯部分多酚和黄酮类物质得到富集，含量最高。不同萃取物中的总还原力和总酚含量之间呈现出明显的量效关系，即总酚和总黄酮含量高的萃取相，总还原力也强。由此推断，高活性菌株LTS-6-6发酵产物的抗氧化活性物质主要是多酚类和黄酮类。

2.2.2 不同浓度LTS-6-6萃取物对DPPH·的清除率

高活性菌株LTS-6-6不同浓度萃取物对DPPH·清除率见表3和图5。

表3 不同部位萃取物对DPPH·清除率

续表3(Continued Tab.3)

浓度Concentration(mg/mL)供试样品清除率Scavenging effects of different samples(%)VCPEEEAEBAEWTE0.04096.74±0.0065.20±2.7494.94±0.3553.12±0.0919.79±0.420.05096.89±0.0474.78±0.4395.02±0.0264.36±2.6326.46±1.050.10097.10±0.0391.68±0.1497.79±2.4794.79±0.0050.45±0.00

图5 高活性菌株不同萃取物对DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging effects of different extracts from LTS-6-6 on DPPH· radical

由表3和图5可看出，高活性菌株发酵产物不同萃取物对DPPH·均表现出一定的清除能力，清除率都随着浓度增大而升高，增大幅度均呈现出先逐渐增大后趋于稳定的现象。在0～0.1 mg/mL的浓度范围内，EAE活性显著高于其他萃取物；在0.02 mg/mL时，EAE对DPPH·的清除率即达到88.97%，其EC50为7 μg/mL，仅次于VC(EC50为4 μg/mL)。在0.1 mg/mL时，PEE和BAE对DPPH·的清除率分别为91.81%和94.79%，EC50分别为26 μg/mL和33 μg/mL。WTE对DPPH·的清除能力最弱，在0.1 mg/mL时清除率仅为50.44%，EC50为109 μg/mL。由此看出，不同萃取物中，对DPPH·清除能力由高到低依次为EAE>PEE>BAE>WTE，说明抗氧化活性物质主要集中在乙酸乙酯萃取相。这与图4所示乙酸乙酯萃取相中总酚和总黄酮含量最高的结果相一致。这为高活性菌株LTS-6-6中的抗氧化活性物质的后续分离纯化提供了重要参考依据。

3 结果与讨论

本研究采用总还原力测定(FRAP法)和DPPH·自由基清除率评价了29株核桃内生真菌的抗氧化能力，供试菌株均表现出一定的抗氧化能力，其中以核桃青果皮中分离得到的菌株LTS-6-6抗氧化能力最强。

抗氧化剂可以抑制自由基的反应过程或干扰自由基连锁反应的引发与扩散过程，本研究以总还原力测定(FRAP法)和DPPH·自由基清除率两种方法，对核桃内生真菌的发酵产物的抗氧化活性进行探索，由于两者的抗氧化作用机制不同，研究结果也稍有差异。本研究结果显示，BAE的总还原力高于PEE，但在DPPH·清除试验中，BAE的清除能力较弱，EC50略高于PEE。

部分内生真菌能够参与植物活性成分的合成，产生与宿主植物相同的化合物及其衍生物[15]。Wei等[16]通过DPPH·及ABTS+·法评价了核桃青皮的抗氧化能力，结果发现，核桃青皮80%乙醇提物抗氧化能力与VC相当，并且总酚含量和抗氧化能力呈正相关关系。在本试验中，高活性菌株LTS-6-6从核桃青果皮中分离得到，其发酵产物也表现出较好的抗氧化活性，这可能与宿主共生理论有关。另外，Pan等[17]报道的川贝母内生真菌中的抗氧化活性成分为多酚类、黄酮类物质。Huang等[18]研究了29株传统中草药分离到的内生真菌的抗氧化活性，并发现其抗氧化能力和发酵液中的多酚含量相关性较好。本研究结果与其一致。

核桃是我国重要的经济作物,种植范围广泛，内生真菌资源丰富。Liu等[19]采用组织分离法对蓝田不同季节核桃树的不同组织部位内生真菌进行分离，共分离获得隶属于47个属的核桃内生真菌676株；Yimaer等[20]研究了陕西山阳县、蓝田县与宜君县不同生境春季核桃内生真菌的多样性，从576块组织块中共分离得到392株内生真菌。本研究仅从实验室保存的大量菌株中选择了29株进行抗氧化活性的探索，可供筛选菌株还很多，有望从中发现更有潜在价值的高活性菌株。