痤疮丙酸杆菌生物膜体外模型的成膜规律研究

刘宇甄 曾 荣 徐浩翔 段志敏 林 彤 李 岷

1中国医学科学院皮肤病医院，南京，210042；2江苏省皮肤性病学分子生物学重点实验室， 南京,210042

痤疮是皮肤科最常见的感染性、炎症性皮肤病之一。痤疮丙酸杆菌是其重要的发病环节。微生物感染常大多合并生物膜的形成。这在痤疮患者皮损中也得到了印证。生物膜一旦形成，不仅致病性增加，其对抗菌药物的耐药性也增加[1]。因此针对痤疮丙酸杆菌生物膜的研究是十分重要的。齐显龙等[2]报道了使用扫描电镜观察痤疮丙酸杆菌生物膜构建6天的研究，发现第4天是生物膜的形成最佳时间。然而扫描电镜在观察生物膜时存在制片时会破坏生物膜结构，且仅能观察到生物膜表面结构，无法观察生物膜内部结构等缺陷，从而在微生物生物膜研究领域逐步被有着“显微CT”之称的激光共聚焦显微镜取代。另外完整的生物膜形成过程包含生物膜的黏附、聚集、成熟和播散等四个重要过程。而目前针对痤疮丙酸杆菌生物膜成膜规律的研究尚未见报道。我们的初步预试验发现这个过程大概有20天。因此本研究将使用激光共聚焦显微镜持续20天动态观察痤疮丙酸杆菌生物膜形成及再形成的过程，并对其进行四甲基氮盐[2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt, XTT]细胞活力测定，明确其最佳的成膜时间，为进一步的痤疮丙酸杆菌生物膜研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 痤疮丙酸杆菌(ATCC 11827)购自美国生物标准品资源中心；脑心浸液培养基(Brain-Heart Infusion Broth，BHI)购自英国Oxiod公司；live/DeadTMbacklightTM bacterial viability kit 购自美国ThermoFisher scientific公司； XTT购自美国(Sigma公司；激光共聚焦显微镜购自日本奥林巴斯公司(Olympus-FV1000)；酶标仪(美国Thermo公司)；恒温培养箱(美国Thermo公司)；厌氧培养装置(加拿大STEMCELL Technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备 将冰冻菌株P.acne常温化冻后接种于脑心浸液琼脂培养基表面，置于厌氧培养装置中37℃培养。48 h后挑取单个菌落至50 mL BHI肉汤培养基中进行厌氧37℃振荡培养48 h。振荡后依据麦氏比浊管调整菌悬液浓度为1×108CFUs/mL备用。

1.2.2 生物膜构建 生物膜的体外构建方法参考Capoor等[3]的生物膜的构建法。本研究将构建24孔板生物膜用于激光共聚焦显微镜观察研究。另外构建96孔板生物膜用于XTT细胞活力测定法研究。构建过程大致如下：在24孔细胞培养板需要提前放置无菌细胞爬片。将预先制备的浓度为1×108CFUs/mL BHI培养基菌悬液吸取1 mL至其中。在厌氧培养装进行37℃培养。期间新鲜BHI液体培养基每一至两日更换一次。持续孵育，在预设的不同时间点对生物膜进行测定。96孔板生物膜的过程基本同24孔板，但无需提前放置细胞爬片。

1.2.3 激光共聚焦显微镜 对生物膜结构及厚度测定在预设时间点对痤疮丙酸杆菌生物膜进行染色处理。使用LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit进行染色观察。该染料含有SYTO9(1.67 mM)和PI(1.67 mM)两种荧光染料。前者可以被活菌吸收，在480 nm激光作用下可使活菌显示绿色荧光。后者可以被细菌的DNA或细胞外基质成分吸收，在635 nm激光作用下使上述成分显示红色荧光。在预设的时间点取出24孔板中细胞爬片，加入200 μL 上述染料混合液，厌氧培养37℃孵育30 min，后使用激光共聚焦扫描显微镜进行观察。使用激光共聚焦显微镜自带软件(Olympus fluo view 3.1 viewer)对生物膜进行三维立体结构重建。

1.2.4 XTT法活力测定 XTT用于测定生物膜活体部分的代谢活力，以此评价生物膜的活力，生物膜的生长情况。在预设时间点测量生物膜活力。大致步骤如下：取出含有生物膜的96孔板，先吸弃上清，使用1×PBS清洗生物膜表面3遍。然后每孔加入100 μL XTT(0.5 mg/mL)/Vit.K3(10 mM)混合液。铝箔纸包扎避光，厌氧培养装置中37℃培养3 h。然后吸取上述孔中50 μL上清至酶标仪板中使用490 nm波长光源测定分光光度值。

1.3 统计学方法 所有实验至少重复三次以上。试验数据采用 SPSS 16.0统计软件进行分析，以(均数±标准差) 表示。

2 结果

2.1 痤疮丙酸杆菌生物膜结构的动态观察 生物膜结构形成的动态过程如图1所示。1～3天菌体细胞黏附于载体表面，数量逐渐增多，并初步相互融合，形成微菌落；4～6天出现黄色荧光，表明开始分泌细胞外基质开始逐步形成，且微菌落逐渐融合，生物膜厚度逐渐增加，从而使生物膜三维立体结构逐步形成；7～8天生物膜出现大量黄色荧光，表明菌体产生大量细胞外基质膜，生物膜结构进一步成熟，产生众多黑暗的管道系统分隔，形态多样、纵横交错的孔道贯穿生物膜全层，且在第8天生物膜的厚度为(29.8±2.167)μm；9～10天生物膜菌体开始出现播散，生物膜结构部分破碎，厚度下降；15天生物膜三维立体结构破坏，活菌细胞呈单个游离分布，图片以红色荧光为主，表明菌体细胞大量死亡，反映生物膜结构完全崩解；在第20天部分活菌细胞再次黏附于载体表面，形成新的微菌落群，开始新的一轮生物膜构建。

2.2 痤疮丙酸杆菌生物膜的厚度变化动态观察 生物膜厚度的动态变化过程如图2所示。生物膜构建过程中在菌悬液培养1、2、3、4、5、6、7、8、10、15和20天的厚度分别为0 μm、(4.8±0.867)μm、(9.6±1.156)μm、(14.0±3.391)μm、(18.1±2.588)μm、(20.2±1.33)μm、(24.2±1.643)μm、(29.8±2.167)μm、(28.2±2.387)μm、(21.8±1.789)μm、(20.2±1.303)μm和(11.2±1.483)μm。上述结果显示在1～8天生物膜厚度逐渐增加，到第8天达最高峰，第9～20天生物膜厚度逐渐下降。

2.3 痤疮丙酸杆菌生物膜活力动态变化 生物膜活力动态变化过程如图3所示。生物膜在构建过程中在菌悬液培养1、2、3、4、5、6、7、8、10、15和20天后的XTT法活力测定值分别为0.089±0.014、0.104±0.018、0.158±0.029、0.217±0.044、0.280±0.022、0.319±0.059、0.433±0.048、0.620±0.063、0.421±0.056、0.352±0.157、0.241±0.036和0.155±0.038。上述结果显示在1～8天生物膜的活力逐渐增加，到第8天生物膜活力值达到最佳状态，后在第9～20天后活力逐渐下降。

图1使用激光共聚焦显微镜连续动态观察痤疮丙酸杆菌生物膜的成膜规律(图中横线表示50 μm)：A1～A12分别表示培养0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、15和20 d的生物膜平面图；B1～B12分别表示培养0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、15和20 d的生物膜3D立体结构图

图2 生物膜厚度的动态测定

图3 生物膜活力的动态测定

3 讨论

据报道，临床微生物感染大约有60%存在生物膜的形成[4]。痤疮丙酸杆菌生物膜形态在痤疮患者的炎症性丘疹和非炎症丘疹中均有发现[5]。痤疮丙酸杆菌生物膜形成后其对机体的致病性及对抗菌药物的耐药性显著性增加[6]。因此，进一步深入开展痤疮丙酸杆菌生物膜的研究将有助于加深痤疮丙酸杆菌对机体的致病作用及对抗菌药物的耐药机制认识。目前针对痤疮丙酸杆菌生物膜形成情况尚少，因此本研究将持续20天对痤疮丙酸杆菌生物膜进行动态研究，以期为针对痤疮丙酸杆菌生物膜的研究奠定基础。

细菌生物膜是一种不同于浮游(单个)细胞的存在形式的三维结构菌体细胞群。其主要结构包括菌体及包裹菌体的胞外聚合物(主要为胞外多糖，蛋白质、磷脂、水和胞外DNA等)[7]。目前研究生物膜形态和结构的常用方法主要是各种显微镜技术，如扫描电镜、荧光电镜、激光共聚焦显微镜等[8，9]。电镜技术虽然能够放大足够倍数来观察生物膜的结构。但是在制片过程中的试剂会将菌体杀灭，因此无法观察到活菌状态下生物膜的内部结构。而激光共聚焦显微镜很好的解决了这一问题。当生物膜进行活体染色后，激光共聚焦显微镜不仅对荧光标记的细胞或组织的某一层面获取各种荧光的图像，另外还能对一定厚度的生物膜进行逐层扫描拍摄图像，并经过软件分析能够得到生物膜的三维立体结构图。因此，本研究采用了激光共聚焦显微镜进行痤疮丙酸杆菌生物膜形成、播散和再形成的动态观察研究。

在测定细菌生物膜量及活力方面的常用方法主要是基于每种检测方法与生物膜相互作用后的某种特定成分的分光光度值变化。常用的检测方法有结晶紫染色法、四氮唑盐减低法(MTT)和四甲基氮盐法(XTT)[10,11]。其中XTT法因其操作精确、简便、快速而得到了广泛使用。本研究就采用了该方法对生物膜的活力进行测定。

痤疮丙酸杆菌生物膜最佳形成时间的确定是获得成熟生物膜模型的重要指导。细菌生物膜的形成是一个动态过程，主要包括以下四个阶段：1、黏附：菌体细胞黏附于载体表面；2、聚集：微菌落的形成；3、成熟：分泌细胞外基质，微菌落融合成成熟生物膜；4、播散：菌体细胞和生物膜碎片播散形成新的生物膜[12]。我们的研究目的在于通过激光共聚焦显微镜检测生物膜各个阶段的结构情况并利用XTT法检测生物膜的活力情况来探索痤疮丙酸杆菌生物膜构建的整个过程及其最佳成膜时间。通过对生物膜进行SYTO9/PI染色，观察到痤疮丙酸杆菌生物膜构建过程也同样经历了上述四个步骤。我们研究发现P.ance的生物膜成熟时间较长为8天，而表皮葡萄球菌为24 h[13,14]、金黄色葡萄球菌为24 h[15,16]、铜绿假单胞菌为72 h[17]。生物膜形成时间点差异可能与不同微生物的代谢速度不同相关。痤疮丙酸杆菌生物膜相关研究中使用的生物膜培养的时间从48 h至120 h[18-20]。这些研究只是取了特定的一个时间点生物膜进行相关的耐药性及致病性研究，未对生物膜进行长时间的成膜规律探索。齐显龙等[2]也在体外构建了痤疮丙酸杆菌生物膜模型，最长观察时间为6天，使用的检测方法为XTT法和扫描电镜法，观察到生物膜最佳成熟状态时间是4天。我们的研究目的是探索痤疮丙酸杆菌的成膜规律，包含生物膜的黏附、聚集、成熟和播散等四个重要过程，因此将观察时间设定为20天。我们使用的检测方法为XTT法和激光共聚焦显微镜。我们的研究也发现4天后已经有了生物膜的三维立体结构，但是生物膜的厚度、生物膜的细胞外基质和生物膜的活力在第8天才能达到最佳状态。这种差异可能与以下几方面因素相关：1、菌种不同的差异；2、菌体细胞培养的载体有差异；3、观察时间不一致：该研究最长的观察时间是6天；4、选用的测量方法有差异：该研究使用扫描电镜进行观察，虽然能够将生物膜放大到足够可以看清楚的倍数，但是它的前期标本固定会损伤生物膜活力及完整性，且只能观察生物膜表面的情况，但是无法如同激光共聚焦显微镜那样观察生物膜形成过程中的厚度变化、荧光颜色变化、生物膜的三维立体结构的内部结构变化等。生物膜结构是否成熟与生物膜的厚度、荧光颜色及三维立体结构内部结构密切相关。我们研究观察到在生物膜培养的第8天上述各项指标达到最佳状态。因此，我们认为第8天是生物膜结构最成熟、活力最高的阶段。

痤疮丙酸杆菌生物膜是痤疮致病及对抗菌药物耐药的重要原因。我们通过激光共聚焦显微镜检测法和XTT活力测定法动态观察了痤疮丙酸杆菌形成生物膜从构建、播散、再构建的全过程，从中进一步明确了生物膜结构最成熟的时间是培养的第8天。上述研究结果将有助于研究人员开展痤疮丙酸杆菌生物膜方面的深入研究，进而将有利于进一步阐明痤疮丙酸杆菌生物膜的致病机制及其耐药机制。