醒脑颗粒质量标准研究

姜 燕，马冬云

（江苏省连云港市食品药品检验检测中心，江苏 连云港 222006）

醒脑颗粒为江苏省连云港市中医院制备的医院制剂，主要由胆南星、石菖蒲、白蒺藜、玄参、黄芩、生大黄、玉竹、冰片等中药组方，临床用于治疗中风（中脏腑）急性期、风痰火壅于清窍所致神昏、痰涌、腹实不通等，收载于《江苏省食品药品监督管理局医疗机构制剂标准》[1]。本研究中采用薄层色谱（TLC）法对制剂中的黄芩、冰片、大黄、玄参进行定性鉴别[2-5]，采用高效液相色谱（HPLC）法测定制剂中黄芩苷、大黄素、大黄酚含量[6-9]，为其质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；BP211D 型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司，十万分之一）；KQ-500TDB 型高频数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，功率为120 W，频率为40 kHz）；Linomat 型薄层点样仪（瑞士卡玛公司）。

1.2 试药

黄芩苷对照品（批号为110715-201720，纯度为93.5%），冰片对照品（批号为110743-200905，纯度为98.0%），哈巴俄苷对照品（批号为111730-201106，纯度为96.0%），大黄素对照品（批号为110756-201512，纯度为98.7% ），大黄酚对照品（批号为110796-201621，纯度为99.2% ），大黄对照药材（批号为120902-201010），均购自中国食品药品检定研究院；醒脑颗粒（江苏省连云港市中医院制剂室自制，批号分别为20180319，20180110，20180523）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

黄芩：取样品适量，研细，取约4 g，加甲醇15 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。取阴性样品4 g，同法制备阴性对照品溶液。精密吸取上述3 种溶液各6 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（9 ∶1 ∶1，V/ V/ V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 A。

冰片：取样品适量，研细，取约0.3 g，加石油醚（30 ～60 ℃）5 mL，超声处理10 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取冰片对照品，加石油醚（30 ～60 ℃）制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。取阴性样品0.3 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。精密吸取对照品溶液5 μL、供试品溶液及阴性对照品溶液各15 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以二氯甲烷为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在100 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 B。

大黄：取样品适量，研细，取约2 g，加甲醇20 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL 使溶解，再加盐酸溶液1 mL，置水浴中加热30 min，立即冷却，用乙醚振摇提取2 次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。取阴性样品2 g，同法制成阴性对照品溶液。精密吸吸取上述3 种溶液各6 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（30 ～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15 ∶5 ∶1，V/ V/ V）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同的5 个橙黄色荧光主斑点，阴性对照无干扰。详见图1 C。

玄参：取样品适量，研细，取约3 g，加甲醇25 mL，浸泡1 h，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水25 mL 使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2 次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇5 mL 使溶解，作为供试品溶液。取哈巴俄苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。取阴性样品3 g，同法制备阴性对照品溶液。精密吸取上述3 种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（12 ∶4 ∶1，V/ V/ V）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 D。

图1 薄层色谱图

2.2 黄芩苷含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18柱（150mm×4.6mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（47 ∶53，V/ V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

取黄芩苷对照品20.72 mg，精密称定，加70%乙醇溶解制成质量浓度为207.2 μg/mL 的对照品贮备液。精密量取贮备液适量，加70%乙醇制成质量浓度为51.8 μg/mL 的对照品溶液。取样品适量，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，超声处理1 h，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。按处方比例和工艺制备不含黄芩饮片的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取上述3 种溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果见图2，阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。

线性关系考察：精密吸取对照品贮备液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，分别置10 mL 容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，按拟订色谱条件进样测定。以对照品质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=20.825X+629.5，r=0.999 9（n=5）。结果表明，黄芩苷质量浓度在10.36 ～82.88 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

图2 黄芩苷高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取上述对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6 次测定。结果黄芩苷色谱峰面积的RSD为1.10%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20180319）样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件，分别于0，4，8，10，12，24 h 时进样测定。结果黄芩苷峰面积的RSD为1.90%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

从词性看，《北语词表》100词的名词与动词为主，合计占81%；而《鲁迅小说》词表100词中，如表2所示，名、动、代、副、连五类合计占81%。若按照一般语法分类，把时间、方位词和处所词归为名词，那么，《北语词表》100词主要为名词、动词和代词3类，而《鲁迅小说》词表主要是名词、动词、代词、副词和连词5类。

重复性试验：取同一批（批号为20180319）样品6 份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果黄芩苷含量的RSD为0.90%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的同一批（批号为20180319）样品6 份，各0.5 g，精密称定，分别加入对照品贮备液5 mL，再精密加入70%乙醇45 mL。按拟订方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 黄芩苷加样回收试验结果（n=6）

2.2.4 样品含量测定

取 3 批（批号分别为 20180319，20180110，20180523）样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算黄芩苷含量。结果3 批样品中黄芩苷含量分别为1.839，1.904，1.780 mg/g。

2.3 大黄素和大黄酚含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6mm，5 μm）；流动相：甲醇（C）-0.1%磷酸溶液（D），梯度洗脱（0 ～20 min 时60%C→40%D，20 ～35 min 时60%C→40%D，35 ～55 min 时80%C→20%D）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

取大黄素对照品16.75 mg，精密称定，大黄酚对照品16.77 mg，置同一容量瓶中，加甲醇溶解制成质量浓度分别为33.50，33.54 μg/mL 的混合对照品贮备液；分别精密吸取混合对照品贮备液适量，加甲醇稀释成质量浓度分别为8.375，8.385 μg/mL 的混合对照品溶液。取样品适量，研细，取约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加8%盐酸溶液30 mL，超声处理2 min，再加三氯甲烷30 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取5 次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至20 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，滤过，摇匀，即得供试品溶液。按处方比例和工艺制备不含大黄饮片的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

专属性试验：取上述3 种溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果见图3，阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。

线性关系考察：精密吸取混合对照品贮备液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL，分别置10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按拟订色谱条件测定。以对照品质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y大黄素=11.21X+20.49（r=0.999 9），Y大黄酚=11.27X+22.93（r=0.999 9）。结果表明，大黄素、大黄酚质量浓度分别在3.35 ～26.80 μg/mL和3.354 ～26.83 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液，按拟订色谱条件测定连续进样6 次。结果大黄素峰面积的RSD为1.50%（n=6），大黄酚峰面积的RSD为1.70%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20180319）样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件，分别于0，3，9，12，18，24 h 时进样测定。结果大黄素峰面积的RSD为1.60%（n=6），大黄酚峰面积的RSD为1.40%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定。重复性试验：取同一批（批号为20180319）样品6 份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果大黄素含量的RSD为1.60%（n=6），大黄酚含量的RSD为1.60%（n=6），表明方法重复性良好。加样回收试验：取已知含量的同一批（批号为20180319）样品6 份，每份约5 g，精密称定，再取大黄素、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1 mL含大黄素8.421 μg、大黄酚13.742 μg 的对照品混合溶液，精密吸取对照品混合溶液2 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表2。

2.3.4 样品含量测定取 3 批（批号分别为 20180319，20180110，20180523）样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算大黄素和大黄酚含量。结果3 批样品中大黄素含量分别为0.0330，0.0440，0.0299 mg/g，大黄酚含量分别为0.0528，0.0386，0.0496 mg/g。

图3 大黄高效液相色谱图

表2 加样回收试验结果（n=6）

3 讨论

3.1 TLC 鉴别

黄芩：分别考察50%甲醇、75%甲醇和甲醇作为提取溶剂，采用加热回流、超声方法提取，提取时间分别为0.5，1.0，1.5 h，考察乙酸乙酯-甲酸-水（9 ∶1 ∶1，V/V/ V）、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5 ∶3 ∶1 ∶1，V/ V/V/ V）、乙酸乙酯-丁酮-醋酸-水（10 ∶7 ∶5 ∶3，V/V/ V/ V）的上层溶液3 种展开剂。结果以甲醇为溶剂，超声处理30 min，乙酸乙酯-甲酸-水（9 ∶1 ∶1，V/ V/V）为展开剂所得溶液的TLC 图斑点清晰，分离度好，阴性对照无干扰。

冰片：分别采用正己烷、石油醚（30 ～60 ℃）作为提取溶剂，采用振摇、超声方法提取，提取时间分别为5，10，30 min。结果以石油醚（30 ～60 ℃）超声10 min 提取得到的TLC 图斑点清晰，分离度好，结果稳定。

3.2 含量测定

黄芩苷：分别考察50%乙醇、70%乙醇、乙醇作为提取溶剂，采用加热回流和超声方法提取，提取时间分别为0.5，1.0，1.5 h，考察甲醇-0.1%磷酸溶液（47 ∶53，V/ V）、甲醇-用磷酸调节pH 至2.7 的0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（42 ∶58，V/ V）[10]和乙腈-用三乙胺调节pH 至5.0 的0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液（14 ∶86，V/ V）[11]3 种流动相。结果以70%乙醇超声处理1 h，甲醇-0.1%磷酸溶液（47 ∶53，V/ V）为流动相得到的色谱图峰形对称，分离度大于1.5。

大黄素和大黄酚：分别考察甲醇-0.1%磷酸溶液和0.05%的磷酸水溶液-乙腈[12]2 种流动相，选用等度和梯度2 种洗脱方式。结果以甲醇-0.1%磷酸为流动相的梯度洗脱，大黄素和大黄酚理论板数高，峰形对称，分离度大于1.5。