正交试验法优选口疮穴位贴提取工艺

周秋娟，瞿发林，董文△

（1. 江苏省常州市武进区中西结合医院，江苏 常州 213003； 2. 中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院，江苏 常州 213003）

口疮穴位贴处方为联勤保障部队第九〇四医院中医科验方“口疳散”，由生大黄、吴茱萸、细辛、肉桂、川黄连5 味中药组方，将5 味中药研粉以醋调匀，搓制成直径约为1 cm 的药球，敷贴于双足底涌泉穴处，固定，夜敷昼去。方中生大黄、黄连味苦性寒，清热泻火，用于上焦中焦实火上炎；吴茱萸、细辛、肉桂为温里药，用于浮越之火引火归原，导热下行[1-2]。方中吴茱萸、细辛、肉桂、川黄连4 味中药的主要成分有挥发油类、生物碱类、黄酮类等，其中挥发油类和生物碱类是其发挥药理作用的主要物质基础[3-7]。为了提升中药有效成分的利用率，最大限度发挥中药验方的功效，将口疮穴位贴处方中吴茱萸、细辛、肉桂、川黄连4 味中药，用乙醇提取浓缩成稠膏后，再加入生大黄细粉及适量醋调制成贴剂。本研究中采用正交试验，以吴茱萸碱含量及浸膏量为综合评价指标，优选提取工艺，为口疮穴位贴的研制和生产提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 系列高效液相色谱仪，Waters CapLC2487 型双λ 吸光度检测器，Empower2 数据处理系统（美国Waters 公司）；FA1004 型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司·天平仪器厂，精度为万分之一）；AE240S型电子分析天平（梅特勒-拖利多仪器有限公司，精度为十万分之一）；R201 型旋转蒸发仪，SHB-3 型循环水式多用真空泵（上海申胜生物技术有限公司）；HHS 型恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；YB-ⅠA 型真空恒温干燥箱（天津市金洲科学仪器有限公司）。

1.2 试药

吴茱萸（浙江产，批号为181118），细辛（辽宁产，批号为181118），肉桂（广东产，批号为180807），川黄连（四川产，批号为181221），均购自江苏华洪药业科技有限公司，经联勤保障部队第九〇四医院瞿发林主任药师鉴定为芸香科植物吴莱英Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth. 的干燥近成熟果实，马觉铃科植物北细辛Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var. 的干燥根和根茎，樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl. 的干燥树皮，毛莫科植物黄连Coptis chinensisFranch. 的干燥根茎；吴茱萸碱（南京世洲生物科技有限公司，批号为201901WZYJ，规格为20 mg，含量按98%计）；甲醇及乙腈为色谱纯，乙醇为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 吴茱萸碱含量测定[8]

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Lichrosphe C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（50 ∶50）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：225 nm；进样量：20 μL。

图1 高效液相色谱图

2.1.2 溶液制备

称取60 ℃干燥至恒重的吴茱萸碱对照品9.7 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，即得对照品溶液，摇匀，备用。精密量取每个煎煮水平的药材提取液适量（2%），减压浓缩至干，残渣加甲醇超声溶解3 次，每次8 mL，并定溶至25 mL 容量瓶中，摇匀，以0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。取细辛、肉桂、川黄连3 味药材同法回流提取，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：取2.1.2 项下3 种溶液适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。结果阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。

线性关系考察：精密吸取对照品贮备液，分别制成质量 浓度为97.00，48.50，24.25，19.40，12.12，9.7 μg/mL 的系列溶液，按拟订色谱条件进样测定，以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，以最小二乘法进行直线回归，得回归方程Y=35 532X+14 074，r=0.999 9（n=6）。结果表明，吴茱萸碱进样量在1.94 ～0.194 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取质量浓度为48.50 μg/mL的对照品溶液，按拟订色谱条件重复进样6 次，记录峰面积。结果吴茱萸碱峰面积的RSD为0.87%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.1.2 项下同一份供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h 时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果吴茱萸碱峰面积的RSD为1.78%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

重复性试验：依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定6 次，记录峰面积。结果吴茱萸碱峰面积的RSD为1.76%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的口疮穴位贴提取液5.0 mL，分别按高、中、低质量浓度加入对照品贮备液（吴茱碱97.00 μg/mL）2.0，5.0，10.0 mL，平行制备6 份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.2 浸膏得率测定[9]

蒸发皿预处理：蒸发皿105 ℃烘5 h，取出，置干燥器中冷却至室温，称定质量（W1），继续烘1 h，取出，置干燥器中冷却至室温，称定质量（W2），当│W1-W2│≤0.3 mg 时，置干燥器中存放，备用。

浸膏量测定[8]：剩余提取液于电热恒温水浴锅80 ℃减压浓缩至稠膏状，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘5 h，取出，置干燥器中冷却至室温，称定质量（W3），继续烘1 h，取出，置干燥器中冷却至室温，称定质量（W4），直到│W3-W4│≤0.3 mg。浸膏 量=（W4-W2）/98%，浸膏得率=（浸膏量/药材量）×100%。

2.3 评分标准制订

以口疮穴位贴提取物浸膏量和吴茱萸碱含量作为评价指标，以加权评分法计算综合评分，根据2 个指标的重要程度，将口疮穴位贴提取物浸膏量和吴茱萸碱含量的权重系数分别定为0.3 和0.7，二者综合评分计算公式为：总分= [（浸膏质量/浸膏质量max×0.3）+（吴茱萸碱含量/吴茱萸碱含量max×0.7）]。

2.4 正交试验优选

因素与水平：以乙醇浓度（因素A）、乙醇用量（因素B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D）为参考因素，以口疮穴位贴提取物浸膏量和吴茱萸碱含量作为评价指标，设4 个因素3 个水平。详见表2。

表2 正交试验因素水平表

正交试验设计：按处方配比分别称取吴茱萸、细辛、肉桂、川黄连4 味中药材置三颈圆底烧瓶中，按煎煮因素水平回流提取（煎煮前先将药材浸泡1 h），提取液用8 层纱布压榨滤过，合并提取液，搅匀，得口疮穴位贴的药材提取液。依法行L9（34）正交试验，测定浸膏量和吴茱萸含量。结果见表3。

表3 L9（34）正交试验结果（n=9）

注：*指总药材35.5 g（吴茱萸25 g，细辛5 g，肉桂2.5 g，川黄连3 g）。

结果分析：由表3 可见，各因素影响程度为A ＞D ＞C ＞B。由表4 可见，因素A（F=392.315 3，P＜0.01）对提取工艺影响极显著，因素D（F=94.656 4，P＜0.05）对提取工艺影响显著。可见，最佳提取工艺应为A1B3C2D3，即12 倍量70%乙醇，回流提取3 次，每次1.5 h。

表4 方差分析结果

注：F0.05（2，2）=19.00，F0.01（2，2）=99.00。

2.5 最佳工艺验证

按优选的最佳提取工艺制备5 批样品，测定浸膏量和吴茱萸碱含量，进行综合评分。结果口疮穴位贴浸膏平均量为11.18 g（RSD=1.51%，n=5），吴茱萸碱含量为65.93 mg（RSD=1.07%，n=5）。详见表5。

表5 最佳提取工艺验证试验结果（n=6）

3 讨论

穴位敷贴疗法是以中药经络学为理论依据，通过刺激穴位，发挥药物及穴位的双重功效达到治病、防病的目的一种疗法。涌泉穴是肾经井穴，古代采用药物敷贴涌泉穴治疗脚气、厥证、狂证、口咽病、耳病、鼻病、目疾及难产等多种常见症，现代采用药物敷贴涌泉穴治疗腹泻、便秘、呕吐、哮喘、失眠、高血压、疼痛、口疮等病证[10-13]。

中药穴位贴组方多是古方或中医验方，是将中药碾成细末后，以水、醋、酒等为基质，制成散剂、糊剂和膏剂等剂型，直接贴于穴位患处，为无创伤性外治疗法的药物制剂。中药穴位贴多为散剂、糊剂和膏剂的传统剂型，皮肤外敷给药起效较慢，且人体所吸收的药量有限。为了提升中药穴位贴有效成分的利用率，最大发药物功效，满足现代人使用方便的需求，将口疮穴位贴处方中含有主要成分为挥发油类、生物碱类、黄酮类等发挥主要药理作用的吴茱萸、细辛、肉桂、川黄连4 味中药进行制剂工艺优选。

本研究中采用高效液相色谱法，以提取物浸膏量和吴茱萸碱含量为综合评价指标，通过正交试验法优选出了口疮穴位贴的最佳提取工艺。经验证试验，该提取工艺简单、可行、稳定，可为制剂的开发与使用提供参考。