TP53 基因沉默介导PI3K/PTEN/AKT 信号通路对肾透明细胞癌侵袭转移的调控机制

刘晓丽，庞文帅，黄朝康，朱 磊

（河北医科大学附属邢台市人民医院病理科，河北 邢台 054001）

肾癌是一类多基因相关肿瘤，发病机制复杂[1]。研究发现，细胞内环境紊乱（细胞内信号转导途径不平衡）为主的机体内环境失衡被认为是肿瘤发展的重要因素[2]。同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）为常见抑癌基因，PI3K/PTEN/AKT 信号通路处于肿瘤细胞生长调节的中心环节，该通路的活化可抑制外源性刺激对肿瘤细胞凋亡的诱发作用，进而促进细胞的生存能力和增殖转移，在肿瘤进程中发挥重要作用[3]。PI3K/PTEN/AKT信号通路关联基因之一肿瘤蛋白p53 基因（TP53）为常见促癌基因，参与众多肿瘤发病[4]。本研究中探讨了TP53 基因沉默介导PI3K/PTEN/AKT 信号通路对肾透明细胞癌侵袭转移的调控机制，为临床肾透明细胞癌的治疗提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂：DMEM 培养基（美国Gibco 公司）；Lipofectamine®2000 转染试剂、Trizol 试剂盒均购自美国Invitrogen 公司；表达载体构建（北京信诺金达生物科技有限公司）；免疫组化和Western Blot 抗体（英国Abcam 公司）；DAB 显色底物、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、RIPA 裂解液、CCK-8 试剂、ECL 发光液均购自上海碧云天生物技术有限公司；PCR 扩增仪、ABI7500 型定量PCR 仪均购自美国赛默飞世尔科技公司；PCR 引物合成（南京金斯瑞生物科技有限公司）；BCA 定量试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）。

细胞：人肾透明细胞癌细胞株RLC-310（中国科学院上海细胞研究所）；人正常肾脏上皮细胞（江苏齐氏生物科技有限公司）。

患者纳入标准：经病理组织学或细胞学确诊，或有典型临床特征确诊为肾透明细胞癌；年龄32 ～76 岁；术前未接受放化疗或其他抗肿瘤治疗。

患者排除标准：患有其他原发性恶性肿瘤且对本研究产生影响；临床资料不完整；不配合研究。

标本：选取我院2016 年至2018 年收治的手术患者60 例，其中男36 例，女24 例；年龄32 ～76 岁，平均（56.63±7.44）岁，术后病理检查均确诊为肾透明细胞癌。选取患者的肿瘤组织及癌旁组织，各组织标本采集后均置含RNA 保存液的冻存管中，并立即置-80 ℃冻存，备用。标本采集已得到患者本人及其家属同意。

1.2 方法

细胞培养与细胞转染分组：取人肾透明细胞癌细胞株RLC-310，用含10%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基，于37 ℃及5%CO2恒温培养箱内常规培养。细胞生长至70% ～80%融合度时用0.25%胰酶消化，进行传代。RLC-310 细胞转染分组为空白组（细胞不转染，A 组）、阴性对照组[细胞转染短发夹RNA（shRNA），B 组]、shTP53 组（细胞转染TP53 shRNA，C 组）、PTEN 抑制剂bpv 组[细胞转染空载体，PI3K/PTEN/AKT 信号通路激活剂（phen）处理细胞，D 组]、phen+shTP53 组（细胞转染TP53 shRNA，并用phen 处理细胞，E 组）。细胞培养用6 孔板，以1×106个细胞/孔铺板，使用不含血清的DMEM 新鲜培养基，在细胞密度约占培养板80% 时，使用Lipofectamine® 2000 转染试剂将表达载体加入到培养基中进行转染，转染24 h 后加入phen 处理细胞，作用24 h 后更换为含10%胎牛血清的DMEM 2 mL，继续于37 ℃、5% CO2孵箱中培养72 h。将各组RLC-310 细胞接种于24 孔板内，加入DMEM 新鲜培养基至各组细胞中，并置37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养48 h。

免疫组化检测：取出组织标本，用10%甲醛固定，石蜡包埋，5 μm 连续切片。切片在60 ℃恒温箱中烤片1 h，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水；3% H2O2阻断内源性过氧化物酶；微波抗原修复；10%山羊血清封闭；加兔抗人TP53 一抗；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白（IgG）。DAB 显色后，苏木素复染，用中性树脂固定封片。以PBS 代替一抗作阴性对照。在高倍镜下选取5 个视野计数细胞并拍照，着色为棕黄色为阳性表达，根据阳性细胞占全部细胞的比例计算TP53 的阳性细胞率。

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测：采用Trizol试剂盒提取各组RLC-310 细胞的总RNA，取5 μL RNA 样品，用无RNA 酶超纯水稀释20 倍，读取其在紫外分光光度计260 nm 和280 nm 波长处的吸光度，测定RNA浓度和纯度。用PCR 扩增仪进行逆转录反应合成cDNA模版，应用ABI7500 型定量PCR 仪进行实时定量RTPCR 试验。采用相对定量法计算，用2-ΔΔCt表示各目的基因的相对表达量，每个试验均重复3 次，取平均值。

Western Blot 检测：将各组RLC -310 细胞加入100 μL RIPA 裂解液裂解，预冷PBS 洗3 遍，将细胞刮下，移至1.5 mL 离心管中使细胞充分裂解，14 000g离心10 min，取上清液置-20 ℃保存。试验时再将样品取出，用BCA 定量试剂盒进行定量，后加入上样缓冲液，95 ℃煮10 min 后，上样30 μg，在100 V 电压下电泳90 min，通过聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离蛋白后采用湿转方法将蛋白转膜，用5% BSA 室温下封闭1 h 后孵育一抗，4 ℃过夜。其中一抗为TP53、PTEN、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、AKT、GAPDH。一抗孵育完毕后，用1×TBST 溶液室温下摇床摇动洗膜，每次5 min，洗3 次，加一抗相应的二抗山羊抗兔IgG -HRP 温育后放入ECL 发光液显色。利用Quanity One 软件进行蛋白条带灰度分析。

CCK-8 法检测：取各组RLC-310 细胞进行常规消化，用含5%胎牛血清的DMEM 培养基重悬细胞并计数，以5.0×103个/孔接种于96 孔板中，每组设3 个复孔。置培养箱分别培养24，48，72，96 h 后，吸去培养基，PBS 冲洗，加入100 μL 无血清培养基和10 μL CCK-8液体，37 ℃孵育30 min 后，用酶标仪于490 nm 波长处读取吸光度，取重复试验的平均值，绘制生长曲线。

创口愈合试验：各组细胞转染48 h 后，接种至24孔板中，待细胞生长至密度为80% ～90%时进行转染，转染6 h 后更换新的培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基，培养至细胞长满培养板，使用枪头垂直于细胞培养板划痕，然后使用PBS 溶液冲洗细胞3 次，在0，24，48 h 拍照并测量划痕宽度。计算创口愈合率。

Transwell 侵袭试验：收集各组转染细胞重新悬浮于无血清培养基中，取细胞悬液接种于Transwell 的上室，每孔15 μL，37 ℃包被1 h。在小室下层孔中加入750 μL含15%胎牛血清的DMEM 完全培养基，将Transwell 小室置入37 ℃、5% CO2培养箱培养48 h，用棉棒擦去嵌室底部内表面未穿透的细胞及Matirgel 胶，4%甲醛固定，结晶紫染色。在显微镜下计数5 个单独视野的穿膜细胞数。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计学软件进行分析。计量资料以表示，两组间及多组间均数比较行t检验及单因素方差分析；计数资料以率（%）表示，行χ2检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TP53 蛋白阳性表达检测结果

各组织切片中TP53 蛋白表达呈阳性，染色为棕黄色，详见图1 A。与癌旁组织组相比，癌组织组的TP53蛋白阳性表达率显著增加[36.67%（22/60）vs.80.00%（48/60），P ＜0.05]，详见图1 B。

2.2 细胞mRNA 和蛋白表达水平

qRT-PCR 检测结果发现，与人正常肾脏上皮细胞相比，RLC-310 细胞的TP53 的mRNA 表达水平显著增加，组间比较，差异有统计学意义[（0.98±0.04）vs.（1.64±0.07），P ＜0.05]。细胞转染分组后，qRT-PCR和Western Blot 检测各组细胞TP53，PTEN，PI3K，AKT基因的mRNA 和蛋白表达水平见图2 和图3。可见，与A 组相比，B 组的TP53，PTEN，PI3K，AKT mRNA 和蛋白表达水平均无显著变化（P ＞0.05）；C 组的TP53，PI3K，AKT mRNA 和蛋白表达水平显著下降，PTEN mRNA 和蛋白表 达水平均显 著上升（P ＜0.05）；D 组TP53，PI3K，AKT mRNA 和蛋白表达水平均显著上升，PTEN mRNA 和蛋白表达水平均显著下降（P ＜0.05）；E 组的PTEN，PI3K，AKT mRNA和蛋白表达水平均无显著变化（P ＞0.05），TP53 的mRNA 和蛋白表达水平均显著下降（P ＜0.05）。

图1 TP53 蛋白阳性表达检测结果

图2 各组细胞qRT-PCR 检测结果

图3 各组细胞Western Blot 检测结果

2.3 细胞转染后增殖能力

各组RLC-310 细胞的增殖能力见图4。可见，与A 组相比，B 组和E 组的增殖能力均无显著变化（P ＞0.05），C 组的增殖能力显著降低（P ＜0.05），D 组的增殖能力显著升高（P ＜0.05）。

图4 各组细胞增殖能力比较（490 nm）

2.4 细胞转染后迁移和侵袭能力

各组RLC-310 细胞通过划痕愈合试验和Transwell试验分别检测其迁移和侵袭能力，通过测量各组细胞划痕宽度变化来计算迁移率，并通过侵袭细胞数计算侵袭率，结果见图5。可见，与A 组相比，B 组和E 组的迁移率和侵袭率均无显著变化（P ＞0.05），C 组的迁移率和侵袭率显著降低（P ＜0.05），D 组的迁移率和侵袭率显著升高（P ＜0.05）。

图5 各组细胞迁移能力和侵袭能力比较

3 讨论

肾透明细胞癌属肾实质癌常见类别，起病隐匿，是来源于肾小管上皮细胞的腺癌[5]。作为常见泌尿系统恶性肿瘤，肾癌的发病率和死亡率均较高，且呈逐年上升趋势[6]。肾癌常见治疗手段为手术治疗，根治性肾切除多用于早期局限性肾癌，但尚有部分肾癌患者因远处转移而无法接受手术治疗，生存率极低，预后较差[7]。同时，晚期肾癌及转移性肾癌患者均具有较强耐药性[8]。随着对肾癌分子机制认识的深入，有研究发现传统肿瘤疗法缺乏特异性，并伴有明显毒副作用[9]，已不能满足当代肿瘤治疗的需求。近年来，信号转导途径中的某些关键分子已成为分子靶向治疗的研究热点。该治疗基于肿瘤分子生物学，以肿瘤特异性分子作为靶点，应用分子制剂，确认可供治疗干预的分子靶点（促癌基因、抑癌基因、信号转导通路等）。

诸多信号转导途径中，PI3K/PTEN/AKT 信号通路是目前研究较成熟的通路，其活化可促进细胞生长转移[10]。PTEN 是该通路的主要因子之一，可抑制PI3K 的功能并对抗AKT 的活化，在多类肿瘤如脑胶质瘤中等均存在缺失或突变[11-12]。同时，PI3K 的关键功能在于介导组织细胞凋亡，活化的PI3K 可激活细胞信号转导，并与AKT 蛋白相互作用，转位至细胞核或细胞浆，进而调控细胞活性，并抑制细胞凋亡[13]。本研究结果显示，TP53 蛋白在肾透明细胞癌中呈阳性表达，且与癌旁组织组相比，癌组织组的TP53 蛋白阳性表达率显著增加，提示TP53 异常高表达可能与肾透明细胞癌的发病有关，该推测在细胞试验中亦得到证实，RLC -310 细胞的TP53 的mRNA 表达率显著高于正常人肾脏上皮细胞中的水平。另外，推测该蛋白可能通过促进细胞增殖诱发该肿瘤的发生。若可抑制TP53 表达或干扰其目标信号转导通路，可为该肿瘤的早期诊断和治疗提供新思路。

qRT-PCR 和免疫印迹法检测各组细胞TP53，PTEN，PI3K，AKT 基因的mRNA 和蛋白表达水平的结果显示，抑制TP53 基因表达可抑制PI3K/PTEN/AKT信号通路的激活，诱发抑癌基因PTEN 活性，而phen 处理可导致该信号通路的激活，并抑制PTEN 活性；沉默TP53 基因可逆转phen 诱导的PI3K/PTEN/AKT 信号通路的激活，有助于抑制该肿瘤的发生、发展。上述结果经各组细胞转染后增殖能力、迁移能力和侵袭能力比较，验证了沉默TP53 基因表达在抑制phen 诱导的肾透明细胞癌细胞浸润转移中的作用。

综上所述，TP53 在肾透明细胞癌中高表达，可通过抑制该基因的表达来发挥肿瘤抑制作用，TP53 基因可作为肾透明细胞癌诊疗的指标。沉默TP53 基因抑制PI3K/PTEN/AKT 信号通路，从而抑制肾透明细胞癌细胞浸润转移功能，并可逆转phen 诱导的肾透明细胞癌细胞浸润转移，对肾透明细胞癌的诊治作用显著。