北沙参不定根诱导及悬浮培养研究

苗晓燕，王 琳 (保定学院生化系，河北保定071000)

北沙参(Radix Glehniae)，又名海沙参、野沙参、羊乳根等，为伞形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis Fr.Schmidtex Miq)的根，为沙参属多年生草本植物，山东、河北、内蒙、辽宁为其主产区。其嫩茎叶均可入蔬，其根为著名的中药材，与人参、玄参、丹参、党参并称为五参。研究表明，北沙参的主要活性成分有欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、补骨质素等14种香豆素，还有一种香豆素苷元、多糖、生物碱及挥发油等。药理学研究和临床实践表明香豆素类成分是主要的有效成分，具有止咳化痰［1］、抗突变［2］、抗菌［3］、抗肿瘤［4］和镇痛镇静［5］等作用。

目前，利用生物技术进行重要资源繁殖并大规模生产其有效成分已成为一条新的发展途径。其中根培养可以使次生代谢产物的合成能力明显提高［6］。近年来，国内外通过培养不定根生产有用次生代谢产物的研究日益活跃，此技术已在人参［7－9］、白术［10］、甘草［11］等植物中获得成功。笔者拟采用不同途径获得北沙参不定根，进而探究NAA、IBA及蔗糖对其不定根增殖的影响，以期为后续利用生物反应器大量扩繁北沙参不定根提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 北沙参，采集于安国药材种植基地。

1.2 仪器与设备 低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)、电子天平(LP303型，常熟市衡器厂)、全温振荡器(中国哈尔滨东联电子技术开发公司)、超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)

1.3 方法

1.3.1 北沙参不定根诱导。取新生北沙参的的叶片和茎段为外植体，自来水冲洗10 min，移至超净工作台，用70%乙醇泡20 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞消毒8 min，无菌水洗涤3次，无菌滤纸吸干。

方法1:用解剖刀切成1 cm左右茎段，接种于B5+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L 蔗糖培养基中，pH 5.8，温度(25±1)℃，暗培养。

方法2:用解剖刀将叶片表面划伤，接种于B5+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L 蔗糖培养基中，pH 5.8，温度(25±1)℃，暗培养。

方法3:取一定量保定学院生化系细胞生物学实验室诱导的愈伤组织［12］，转接至 MS 液体培养基中，pH 5.8，(25 ±1)℃，110 r/min振荡培养20 d。

1.3.2 蔗糖浓度对北沙参不定根生长的影响。将不定根剪成0.5～1.0 cm的小段，分别接种于含不同浓度蔗糖(10、20、30、40、50 g/L)的MS 液体培养基中，转速110 r/min，温度(25±1)℃，振荡培养21 d收获。

1.3.3 IBA浓度对北沙参不定根生长的影响。将不定根剪成0.5 ～1.0 cm 的小段，分别接种于含不同浓度 IBA(1、2、3、4、5、6 mg/L)的MS(上述适宜浓度蔗糖)液体培养基中，转速110 r/min，温度(25±1)℃，振荡培养21 d收获。

1.3.4 NAA浓度对北沙参不定根生长的影响。将北沙参不定根剪成0.5～1.0 cm的小段，分别接种于含不同浓度NAA(0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mg/L)的 MS+IBA(上述适宜浓度)+蔗糖(上述适宜浓度)液体培养基中，转速110 r/min，温度(25±1)℃，振荡培养21 d收获。

1.3.5 北沙参不定根生长曲线的测定。将北沙参不定根接种至100 ml MS培养基中(含上述筛选出的合适浓度IBA、蔗糖和NAA)，置于摇床(25℃，110 r/min)中振荡培养。分别在第0、3、6、9、12、15、18、21 天随机取出3 瓶，测定其生长量。

1.3.6 北沙参生物量的测定。将培养至21 d的不定根取出，滤纸吸干水分，称重即为湿重;50℃烘干后，再称重即为干重。

2 结果与分析

2.1 不同途径诱导北沙参不定根情况 由图1可知，3种不同途径均可诱导出不定根，但从诱导出的不定根状态来看，叶片和茎段诱导出的根较纤细，数量较少。而由愈伤组织诱导出的不定根粗壮，细长，乳白色，且生长速度快。因此，愈伤组织诱导不定根作为获得北沙参不定根是较简单和理想的途径。

2.2 不同浓度蔗糖对北沙参不定根生长的影响 研究发现，当蔗糖浓度较低时，根的生长速度缓慢，分支少，随着蔗糖浓度的增加，不仅鲜重和干重呈加速上升的趋势，且根的颜色呈白色，分支增多。由图2可知，浓度为40 g/L的不定根鲜物重(4.48 g)和干物重(0.54 g)达到最大值，之后生长量呈较稳定的趋势，说明较低浓度的蔗糖溶液不利于不定根的生长，适当增加浓度可加速不定根的生长，但浓度过高则又会抑制其生长，这可能与高浓度蔗糖导致细胞内渗透压过高有关［13］。因此较适合不定根生长的蔗糖浓度为40 g/L。

2.3 不同浓度IBA对北沙参不定根生长的影响 分别考察了1、2、3、4、5、6 mg/L 共6 个浓度 IBA 对北沙参不定根增殖的影响。由图3可知，随IBA浓度升高，北沙参不定根的鲜物重和干物重均呈增加趋势，当IBA浓度达到4 mg/L时，鲜物重(5.93 g)和干物重(0.69 g)均达到最大值，此时北沙参不定根生长状态最好，新长出来的不定根新鲜，根系粗壮，颜色乳白，生长旺盛。当IBA浓度继续增加时，培养的不定根颜色逐渐变为褐色，部分开始死亡，且鲜重和干重均呈逐渐下降趋势。说明过高浓度的IBA对北沙参不定根的生长具有一定的抑制作用。

2.4 不同浓度NAA对北沙参不定根生长的影响 由图4可知，当用0.8 mg/L NAA处理北沙参不定根时，其生长状态最好，鲜物重(7.44 g)和干物重(0.75 g)均达到最大值。且发现，随着NAA浓度的提高，北沙参不定根会发生轻微的愈伤化，即在根的周围出现透明隆起，且培养基中出现一定的小细胞团。因此，综合考虑北沙参不定根的生长状态及生物量，发现0.8 mg/L NAA较适合北沙参不定根的生长。

2.5 北沙参不定根生长曲线 分别在不定根生长的不同天数(0、3、6、9、12、15、18、21 d)进行取样测定其生长量，结果见图5。由图5可知，北沙参不定根的生长曲线呈近S型，0～3 d为延滞期，3～12 d不定根快速生长，进入对数生长期，12 d后趋于平稳，生物量略有下降。说明随着北沙参不定根的生长，营养物质逐渐被消耗，当不能满足根的生长时，根将逐渐出现褐化的现象。

3 结论与讨论

该试验采用3种途径进行北沙参不定根的诱导，结果表明，利用愈伤组织在MS培养基中能较快速地获得不定根。随后又考察了IBA、NAA和蔗糖3种因素对北沙参不定根生长的影响，发现当蔗糖浓度为40g/L、IBA浓度为4mg/L、NAA浓度为0.8 mg/L时，较有利于不定根的生长，可明显提高其生物量，这说明适宜比例的NAA和IBA组合对植物不定根的形成和生长具有一定的促进作用。这将为后续利用生物反应器大规模生产北沙参不定根获取重要代谢产物——香豆素奠定基础。

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