深圳急性肠胃炎住院患儿中人副肠孤病毒临床和流行病学特征分析

祝亚楠 张海龙 陈龙 姚相杰 杨洪 韩敏 关心 何雅青 胡贵方

1南方医科大学公共卫生学院流行病学系（广州510515）；2深圳市疾病预防控制中心病原生物研究所（广东深圳518036）

人副肠孤病毒（human parechovirus，HPeV）是一种单股正链、无包膜的RNA病毒，属于小RNA病毒科（Picornaviridae）人副肠孤病毒属（Parechovirus），全长约7.3 kb。目前基于VP1序列差异已发现了18种基因型［1］，但VP3/VP1连接区序列也高度变异，也可用于基因分型。HPeV主要通过粪-口和呼吸道途径传播，在粪便和呼吸道分泌物样本中可检测到病毒脱落，且主要从儿童中分离获得［2］。HPeV感染后除引起胃肠道及呼吸道症状外，还可引发脑炎、无菌性脑膜炎、心肌炎、脓血症及瑞氏综合征等严重疾病［3］。HPeV感染范围广泛，目前已在多个国家报道过该病毒的感染。在国内，自2009年在上海首次报道了HPeV感染［4］，目前仅在少数几个地区有过报道［5-11］，关于HPeV与急性肠胃炎的研究尤其是关于住院儿童的研究还较少。深圳作为国内最重要的口岸城市之一，人口密度高，流动性强，地处亚热带，但目前关于深圳地区急性肠胃炎住院患儿中HPeV的分子流行病学特征尚不清楚。因此，从急性肠胃炎住院患儿粪便标本中检测HPeV，并分析其型别，以充分认识深圳地区HPeV与急性肠胃炎住院患儿之间联系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017年1月至2018年12月5岁以下急性肠胃炎住院患儿497例，以呕吐和腹泻等消化道症状为主诉住院病例，要求病例为发病3 d以内的病例［12］。研究对象来自深圳市疾病预防控制中心感染性腹泻监测网络2家哨点医院，其中男316例，女181例。收集患儿入院前临床资料，并采集粪便标本，经常规细菌检测鉴定为阴性，置-80℃冰箱保存待检。

1.2 核酸提取与HPeV检测 用Hank′s缓冲液将粪便制成20%混悬液，按照核酸提取试剂盒MagNA pure LC Total Nucleic Acid isolation kit（Roche）说明书要求提取样本核酸，所提取核酸保存于-20℃待用。根据HPeV 5′端非编码区设计的引物和探针，采取实时荧光RT-PCR法和Perfect Real Time One-Step Prime Script RT-PCR试剂（TaKaRa）进行HPeV检测［13］。

1.3 HPeV分型 根据HPeV VP3/VP1连接区的两对引物，通过巢式PCR和Prime Script One Step RT-PCR试剂（TaKaRa）对HPeV疑似阳性样本进行基因分型［14］。所获得的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，将符合预期大小的PCR产物送到上海生工生物公司双向测序，测序结果经系统进化分析确定基因型。

1.4 系统进化树构建和进化分析 使用BioEdit进行序列比对（ClustalW法），采用MEGA 7.0软件中邻接法（Neighbor-joining method）建立系统进化树，进化树可靠性估计Boot-strap值设定为1000。HPeV参考株来自GenBank中以测序结果作为查询序列搜索到的核酸相似性最高的同源序列。

1.5 统计学方法 使用EpiData 3.1录入问卷，核对无误后使用SPSS 22.0软件处理数据，采用χ2检验、fisher确切概率检验、t检验方法比较不同特征患儿HPeV阳性率差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 497例患儿中，男316例（63.6%），女181例（36.4%）；患儿月龄最小2个月龄，最大60个月龄，平均月龄（15.3±0.510）个月；2017年、2018年病例数分别为291例、206例。采用实时荧光RT-PCR方法检测HPeV疑似阳性46例，其中2017年29例，2018年17例。采用巢式PCR成功分型的有41例，阳性率为8.2%（41/497），其中2017年26例，2018年15例。

2.2 性别分布 男性HPeV阳性为24例，阳性率为7.6%（24/316），女性HPeV阳性为17例，阳性率为9.4%（17/181），不同性别HPeV阳性率差异无统计学意义（χ2=0.491，P=0.501），见表1。

2.3 月龄分布 HPeV阳性患儿平均月龄（9.5±1.035）个月，HPeV阴性患儿平均月龄（15.7±0.542）个月，二者差异有统计学意义（t=8.919，P=0.003）。各月龄组间0～6个月患儿HPeV阳性率最高（13.8%），其次为7～12个月（13.3%），25～60个月（4.2%），13～24个月（2.3%），差异有统计学意义（χ2=20.777，P＜0.001）。其中92.7%（38/41）的HPeV阳性患儿月龄＜24个月，见表1。

2.4 时间分布 2017年HPeV阳性率为8.9%（26/291），2018年HPeV阳性率为7.3%（15/206），差异没有统计学意义（χ2=0.436，P=0.509），见表 1。从月份分布图看，HPeV感染以炎热季节多见，夏季（7-10月）为检出高峰期，其中7月HPeV阳性率最高（26.3%），6月、11-1月有较低的检出率，2-5月没有HPeV检出，见图1。

2.5 临床症状分析 对所有患儿进行入院调查，其临床表现常见发热、腹泻、呕吐，见表2。其中HPeV阳性患儿平均体温（37.3±0.133）℃，HPeV阴性患儿平均体温（37.1±0.040）℃，体温分布中中热患儿HPeV阳性率最高（11.5%），其次为高热患儿（10.0%）、正常患儿（7.9%）、低热患儿（7.5%），差异无统计学意义（χ2=0.859，P=0.827）。所有患儿入院前都有腹泻症状，从入院前腹泻频率来看，HPeV阳性患儿平均每天腹泻次数（6.1±0.427）次，HPeV阴性患儿平均每天腹泻次数（5.7±0.146）次，在腹泻频率分布中腹泻次数大于每天6次患儿HPeV阳性率最高（10.0%），其次为腹泻次数4～6次/d患儿（7.9%）、腹泻次数小于每天4次患儿（6.4%），差异无统计学意义（χ2=1.167，P=0.558）。从粪便形状来看，伴有黏液便患儿HPeV阳性率最高（19.1%），其次为伴有脓血便患儿（16.0%）、水样便患儿（7.2%），在伴有米泔样便、鲜血便、脓血便、黑便、糊状便、蛋花样便、黄绿稀便中没有HPeV检出，差异无统计学意义（χ2=13.044，P=0.159）。497例患儿中，伴有呕吐症状的患儿有211例，HPeV阳性率为4.7%，无呕吐症状的患儿有286例，HPeV阳性率为10.8%，二者差异有统计学意义（χ2=5.969，P=0.015），HPeV阳性患儿入院前平均每天呕吐次数（5.0±0.829）次，HPeV阴性患儿平均每天呕吐次数（4.9±0.189）次，差异无统计学意义（t=0.001，P=0.999）。从患儿呕吐物性状来看，只在伴有呕吐胃内容物患儿中检测到HPeV，HPeV阳性率为4.7%，在呕吐物为水样和血样内容物的患儿中没有检测到HPeV，差异有统计学意义（χ2=22.902，P＜ 0.001）。

表1 2017-2018年急性肠胃炎住院患儿基本信息和HPeV检测结果Tab.1 Demographic characteristics of hospitalized children with acute gastroenteritis during 2017-2018 and detection rate of HPeV 例（%）

图1 2017-2018年不同月份急性肠胃炎住院患儿HPeV感染情况和每月阳性率分布Fig.1 Seasonality distribution of HPeV infection among hospitalized children with acute gastroenteritis during 2017-2018.The lines indicates the percentage of HPeV-positive samples in each month

表2 HPeV阳性与阴性住院患儿临床特征比较Tab.2 Comparison of clinical characteristic between HPeV-positive and HPeV-negative hospitalized children 例（%）

2.6 HPeV基因型别的分布 41例样本中存在HPeV-1（HPeV-1A和HPeV-1B亚型）、3、4、5、6、14六种型别，且以HPeV-1为主要流行型别，HPeV-1B为优势流行株（56.1%），其次是HPeV-1A（17.1%）。HPeV-3（7.3%），HPeV-4（7.3%）、HPeV-5（4.9%）、HPeV-6（4.9%）和HPeV-14（2.4%）在深圳地区有较低的流行率。此外2017年共检出6种基因型，包括HPeV-1、HPeV-3，HPeV-4、HPeV-5、HPeV-6和HPeV-14，而2018年只检出2种基因型，包括HPeV-1和HPeV-4，见表3。

表3 2017-2018年急性肠胃炎住院患儿中HPeV基因型的流行及分布Tab.3 Prevalence and distribution of HPeV genotypes in hospitalized Children with acute gastroenteritis during 2017-2018 例（%）

2.7 系统进化分析 笔者将深圳分离株和从Gen-Bank获得的HPeV参考株VP3/VP1连接区序列绘制系统进化树，深圳分离株与参考株具有较高的核苷酸一致性，见图2。结果显示：有15株HPeV-1B深圳分离株与参考株FJ840477H/Shanghai/2008和MH921804/Australia/2018进化距离最近，核苷酸相似性范围为94.9%～98.8%。另有1株HPeV-1B（17-171）分离株与参考株LC143414/Japan/2014进化距离最近，核苷酸相似性为91.4%。有2株HPeV-1B（18-107和18-125）分离株与参考株MG517313/South Korea/2015进化距离最近，核苷酸相似性范围为96.0%～96.4%。有5株HPeV-1B深圳分离株与参考株FJ763356/Lanzhou/2006和JQ715735/Lanzhou/2009进化距离较最近，核苷酸相似性范围为93.7%～96.4%。在7株HPeV-1A深圳分离株中，各有3株（17-5、17-157和17-175）、1株（17-4）、3株（17-154、18-99和18-132）分离株分别与参考株MG030372/Australia/2018、JQ715769/Lanzhou/2009和KT591419/Guangzhou/2013进化距离最近，核苷酸相似性范围分别为93.3%～94.5%、93.7%和93.3%～94.1%。在3株HPeV-3深圳分离株中，17-124、17-130和17-167分离株分别与参考株JQ715760/Lanzhou/2009、FJ763360/Lanzhou/2006和MF576080/Netherland/2012进化距离较近，核苷酸相似性分别为97.6%、96.0%和99.2%。此外有3株HPeV-4（17-180、18-87和18-208）分离株与参考株MH921811/Australia/2018和JQ715767/Lanzhou/2009进化距离较近，核苷酸相似性范围为93.8%～94.9%。在2株HPeV-5深圳分离株中，17-249和17-231分离株分别与参考株KF489918/Guangzhou/2013和KY067444/Zhejiang/2015进化距离较近，核苷酸相似性分别为91.5%和98.0%。有2株HPeV-6分离株（17-129和17-189）与参考株MH921749/Australia/2018进化距离最近，核苷酸相似性范围为98.0%～98.4%。还有1株HPeV-14（17-172）分离株与参考株KT591417/Guangzhou/2013进化距离最近，核苷酸相似性为94.9%。

图2 深圳分离株与HPeV参考株VP3/VP1连接区序列系统进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on VP3/VP1 junction region of HPeV-positive samples and HPeV prototype strains

3 讨论

我国不同地区不同年份以及不同样本HPeV的检出率有较大差异，本研究中深圳地区急性肠胃炎住院患儿粪便样本中HPeV检出率为8.2%，且2017年与2018年HPeV检出率差异没有统计学意义，说明HPeV在深圳地区急性肠胃炎住院患儿中保持比较稳定的感染状态。此外与其他地区腹泻住院患儿HPeV检出率相比，与吉林地区HPeV检出率（8.8%）相当［10］，低于兰州地区HPeV检出率（24%）［5］。与其他地区门诊腹泻患儿 HPeV检出率相比，高于香港地区HPeV检出率（2.3%）［6］，低于上海（55.0%）［9］和广州（13.4%）［11］地区HPeV检出率。本研究中男女性HPeV阳性率差异无统计学意义，与国内外的研究报道一致［5-6，9，14-15］，说明HPeV感染无性别差异。HPeV阳性患儿与阴性患儿月龄分布有统计学差异，HPeV阳性患儿平均月龄明显低于阴性患儿月龄，且0～6个月月龄组HPeV阳性率最高，可能这是儿童自身免疫能力尚未完善的时期，感染HPeV的患儿因病情较重而入院治疗。血清学资料显示，90%以上的儿童在两岁前已感染HPeV［16］，本研究表明深圳地区2岁以下患儿中，约有92.7%的患儿携带HPeV。本研究中发现了HPeV感染具有明显的季节性，其中7月HPeV阳性率最高，与吉林地区研究报道一致［10］，7-10月为检出高峰期，这一时间分布与国内其他研究报告的分布略有不同，国内其他研究报告的检测率在7月～8月（上海［9］、兰州［5］、广州［11］）和 9-1月（香港［6］）达到高峰。因此国内地区HPeV感染多以炎热季节多见，这可能主要与炎热季节降雨量多有关［17］。

临床症状分析显示，HPeV感染的急性肠胃炎住院患儿的症状主要表现在中热，每天腹泻频率＞6次/d，以粘液便为主，常伴有呕吐，呕吐频率平均5次/d，呕吐物以胃内容物为主。但HPeV阳性患儿较阴性患儿主要表现在呕吐和呕吐物性状存在统计学差异，而其他症状与HPeV阴性患儿表现相近，不易区分。说明HPeV可能是引起急性肠胃炎住院患儿呕吐的病因，尤其是对于呕吐物为胃内容物的患儿。

研究中共有6种已知型别的HPeV被检出，HPeV-1为主要流行型别，HPeV-1B为优势流行株，与其他地区研究报道一致［6，14，18］，因此 HPeV-1B 似乎是导致胃肠道综合征发生率较高的原因，也有研究表明HPeV-1B常与儿童水样便急性肠胃炎有关［19］。本研究还发现，在深圳HPeV-1A具有相对较高的检测率是一个显著的流行病学特征。此外在深圳地区HPeV-4也常被检测到，这与邻近城市广州［14］和香港［6］非常相似，且这3个地方之间往来频繁。另一方面，在欧洲［20］和一些亚洲城市［16，18］发现具有较高检测率的HPeV-3在深圳却很少被发现。这可能因为HPeV3是引起儿童中枢神经系统感染和脓毒症的主要基因型［21-22］。值得注意的是，在本研究中，很少报道的HPeV-5、HPeV-6和HPeV-14基因型也有检测到，说明HPeV存在多种基因型皆可引起患儿急性胃肠炎。

系统进化树分析结果显示，41例深圳分离株分别与相应参考株有较高的核苷酸序列同源性，包括流行在亚洲的几个地区（上海、兰州、广州、浙江、日本和韩国）、澳大利亚和荷兰的参考株，提示HPeV在世界范围内广泛传播。其中大部分深圳分离株与兰州和广州来源的参考株有较高的核苷酸一致性，提示HPeV进化具有一定的地域性特征。

综上所述，本研究发现HPeV在深圳急性肠胃炎住院患儿中保持稳定的感染率，检测到6种HPeV基因型别可能与急性肠胃炎相关，HPeV炎热季节检出率最高，好发于2岁以下患儿，可能是引起急性肠胃炎住院患儿呕吐胃内容物的病因。本研究首次在深圳地区急性肠胃炎住院患儿中检测到HPeV，补充了急性肠胃炎住院患儿感染HPeV的流行病学和临床特征资料，为本地区HPeV的防治提供有益科学依据，有助于进一步明确深圳地区儿童病毒性腹泻病原谱的构成。但对于HPeV优势流行株变异趋势，本研究仅有2年监测数据，还需要对HPeV进行持续监测，以更进一步的研究HPeV在深圳地区的流行情况。