LncRNA FZD10-AS1通过调控miR-337-3p/GPD1分子轴抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移

李帅 董震 王晓晨 丁涛

1青岛大学附属青岛妇女儿童医院儿童骨科（山东青岛266000）；胜利油田中心医院2药学部，3脊柱外科（山东东营257000）

骨肉瘤是一种最常见的骨原发恶性肿瘤，好发于青年患者［1］。虽然骨肉瘤治疗已取得一定进展，但由于骨肉瘤恶性程度高且进展快，早期即易转移，复发率高，因此骨肉瘤患者的总体预后较差［2-3］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）与细胞多种生命活动如分化、增殖、凋亡、衰老、迁移等行为密切相关［4］。越来越多研究［5-6］表明，lncRNA在多种类型的肿瘤中异常表达，通过多种分子机制参与肿瘤的进展和转移。近年来，lncRNA在骨肉瘤发生、发展中的作用逐渐引起关注［7］。FZD10-AS1是一种新发现的lncRNA，其在骨肉瘤中的表达情况及作用机制尚不清楚。本研究检测FZD10-AS1对骨肉瘤细胞增殖、迁移能力的影响，并研究骨肉瘤细胞中FZD10-AS1对下游靶基因表达的调控作用，为骨肉瘤的分子靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 临床标本收集 收集青岛大学附属青岛妇女儿童医院儿童骨科2016年9月至2018年12月行骨肉瘤根治术切除47例骨肉瘤患者的癌组织及相应癌旁组织，术后立即于液氮中保存。男性和女性患者分别为28例和19例，平均（18.75±8.49）岁。所有患者术前未接受放疗、化疗、生物治疗等。所有组织均经病理切片证实。本研究经本院伦理委员会同意，患者均签署知情同意书。

1.2 细胞与主要试剂 正常成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞MG-63、Saos2、143B、HOS 和U-2OS购自美国标准培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。qRT-PCR相关试剂盒购于日本TaKaRa公司。RPMI 1640培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清购自美国Amresco公司。CCK-8试剂盒购自美国Sigma公司。表达FZD10-AS1的质粒、阴性对照质粒和PCR引物（GAPDH、GPD1、FZD10-AS1、miR-337-3p、U6）购自上海吉玛生物制药有限公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。一抗 GPD1、β-Tubulin、E-cadherin、ZEB-2、CDK7、Cyclin H及二抗均购自美国CST公司。

1.3 细胞培养及质粒转染 143B和HOS细胞培养于添加含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，Saos2、MG-63和U-2OS细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM/F12培养液中，于37℃、体积分数5%CO2孵箱中培养。hFOB1.19细胞培养在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM/F12培养液中，于34°C、5%CO2孵箱中培养。转染前1 d将U-2OS细胞种于6孔板，使用表达FZD10-AS1的质粒或阴性对照质粒分别与Lipofectamine 2000脂质体混合转染U-2OS细胞，操作按照Lipofectamine 2000说明书进行，48 h后进行后续实验检测。

1.4 RNA提取和qRT-PCR 参照TRIzol试剂盒说明书提取骨肉瘤组织和细胞株中总RNA，逆转录后获得cDNA，参照qRT-PCR试剂盒说明书采用相对定量法对组织和细胞中FZD10-AS1、miR-337-3p和GPD1表达量进行检测，miR-337-3p采用U6作为内参，FZD10-AS1和GPD1采用GAPDH作为内参，qRT-PCR反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性50 s，60℃退火25 s，72℃延伸15 s，设置40 次循环。采用 2-ΔΔCt方法计算 FZD10-AS1、miR-337-3p和GPD1 mRNA的表达量。FZD10-AS1上游引物为 5′-CAAGCCCTACAATTTTTACATCG-3′，下游 引 物 为 5′-CCTGCTTCACCTCCTTCTCATA-3′；GPD1上游引物为 5′-GCCATCTGAAGGCAAACGC-3′，下游引物为5′-GCCAATGGTTGTCTCACAGAAC-3′。U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游引物 为 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。GAPDH上游引物为5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物为 5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；miR-337-3p上游引物为 5′-GGGCTCCTATATGATGCCT-3′，下游引物为 5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。

1.5 CCK-8检测U-2OS细胞增殖能力 对照组和观察组处于对数生长期的U-2OS细胞接种于96孔板，每孔5×103个细胞，在37℃、5%CO2培养箱中连续培养5 d。在每天相同的时间点，每孔分别加入10 μL的CCK-8溶液，培养箱中培养4 h，酶标仪检测在450 nm波长下的每孔吸光度（OD）值，绘制U-2OS细胞生长曲线。实验重复3次。

1.6 细胞划痕实验检测U-2OS细胞迁移能力 对照组和观察组处于对数生长期的U-2OS细胞接种于6孔板，每孔3×105个细胞，培养至细胞汇合。采用无菌200 μL移液管尖端在每个孔底进行划痕。采用无菌PBS溶液洗涤3次，充分清除细胞碎片，加入不含血清的培养基培养。24 h后，拍摄记录每孔细胞的迁移状态，并计算迁移率。实验重复4次。

1.7 生物信息学预测FZD10-AS1的下游miRNA及基因 采用LncBase Predicted v.2软件预测FZD10-AS1可互补结合的miRNA，采用PITA和starBase V2.0软件预测miRNA的靶基因。

1.8 Western Blot实验检测GPD1蛋白的表达量采用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，采用半干转移法将蛋白转至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入按一定比例稀释的一抗 GPD1（1∶1 000稀释）、β-Tubulin（1∶1 000稀释）、E-cadherin（1∶500 稀释）、ZEB-2（1∶500）、CDK7（1∶2 000）及Cyclin H（1∶2 000），4 ℃过夜孵育，TBST溶液清洗3次后，加入相应二抗在室温孵育2 h。TBST溶液清洗3次后，加入ECL化学发光液，迅速置于凝胶成像系统中采集图像并观察分析。

1.9 统计学方法 所有数据均使用SPSS 21.0软件分析，计量数据采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FZD10-AS1在骨肉瘤组织和细胞株中表达下调 qRT-PCR检测结果显示，骨肉瘤组织FZD10-AS1表达量明显低于癌旁组织［（1.21±0.45）vs.（5.58± 0.88），P＜ 0.01，图1］，FZD10-AS1在骨肉瘤细胞株中的表达量明显低于正常成骨细胞（P＜0.01，图2），其中在U-2OS细胞中表达量最低。

2.2 转染FZD10-AS1质粒提高U-2OS细胞中FZD10-AS1表达的量 转染FZD10-AS1质粒后，观察组U-2OS细胞中FZD10-AS1表达的量明显高于对照组［（1.00 ± 0.04）vs.（10.55 ± 0.87），P＜ 0.01］。

2.3 过表达FZD10-AS1抑制U-2OS细胞的增殖能力 CCK-8法结果（图3）显示，在第3、4、5天，过表达FZD10-AS1的观察组U-2OS细胞D值明显低于对照组（P＜0.05），表明过表达FZD10-AS1可抑制U-2OS细胞的增殖能力。

图1 FZD10-AS1在骨肉瘤组织和癌旁组织中的表达量Fig.1 Expression level of FZD10-AS1 in osteosarcoma and adjacent tissues

图2 FZD10-AS1在骨肉瘤细胞株和正常成骨细胞中的表达量Fig.2 Expression level of FZD10-AS1 in osteosarcoma cell lines and normal osteoblast cell

图3 过表达FZD10-AS1对U-2OS细胞增殖能力的影响Fig.3 Effect of overexpression FZD10-AS1 on the proliferation of U-2OS cells

2.4 过表达FZD10-AS1明显抑制U-2OS细胞的迁移能力 细胞划痕实验结果（图5）显示，观察组U-2OS细胞迁移率明显少于对照组［（24.52±3.96）%vs.（54.30± 6.06）%，P＜ 0.01］，表明过表达FZD10-AS1可抑制U-2OS细胞的迁移能力。

图4 过表达FZD10-AS1对U-2OS细胞迁移能力的影响Fig.4 Effect of overexpression FZD10-AS1 on the migration of U-2OS cells

2.5 生物信息学软件预测FZD10-AS1互补结合的下游miRNA及基因 采用LncBase Predicted v.2软件预测显示：FZD10-AS1可与miR-337-3p互补结合；PITA和starBase V2.0软件预测显示，miR-337-3p可与GPD1 mRNA互补结合。见图5。

图5 生物信息学软件预测FZD10-AS1互补结合情况Fig.5 Bioinformatics software predicts FZD10-AS1 complementarity

2.6 过表达FZD10-AS1降低或升高U-2OS细胞中miR-337-3p和GPD1 mRNA表达量 qRT-PCR检测结果显示，观察组U-2OS细胞中miR-337-3p mRNA表达量明显低于对照组［（1.02±0.11）vs.（0.22±0.06），P＜0.01］，GPD1 mRNA表达量明显高于对照组［（1.00 ± 0.13）vs.（5.90± 0.52），P＜ 0.01）］，表明过表达FZD10-AS1可下调miR-337-3p mRNA的表达，进而促进GPD1 mRNA的表达。

2.7 过表达FZD10-AS1对GPD1蛋白表达的影响Western Blot检测结果（图6）显示，过表达FZD10-AS1后，GPD1蛋白表达量上调，上皮细胞表型E-cadherin表达升高，间质细胞表型ZEB-2表达降低，细胞周期调控蛋白CDK7、Cyclin H的表达降低。

图6 过表达FZD10-AS1对U-2OS细胞GPD1相关蛋白表达的影响Fig.6 Effect of high-expressed FZD10-AS1 on the expression of GPD1 protein and related proteins in U-2OS cells

3 讨论

可通过多种作用机制如染色质修饰、基因组印迹、转录水平、转录后水平调控基因的表达［8-10］。许多 lncRNA 如 EPIC1、LINC00152、XIST、FBXL19-AS1、MIAT、MIR100HG被发现在骨肉瘤组织中过表达或低表达，在骨肉瘤中发挥促癌作用或抑癌作用［11-17］。FZD10-AS1是一种新发现的lncRNA，本研究显示FZD10-AS1在骨肉瘤组织中的表达量较癌旁组织明显减少，在骨肉瘤中的表达量较正常成骨细胞明显较少，表明FZD10-AS1在骨肉瘤中低表达可能与骨肉瘤的发生有关。本研究通过上调骨肉瘤U-2OS细胞中FZD10-AS1的表达，FZD10-AS1可抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移能力。

LncRNA发挥作用的主要机制是lncRNA作为miRNA“海绵”，竞争性结合并抑制miRNA的活性，降低miRNA对下游基因mRNA的干扰作用，从而促进下游基因mRNA的翻译［18-19］。采用LncBase Predicted v.2软件预测显示，FZD10-AS1可与miR-337-3p互补结合；PITA和starBase V2.0软件预测显示，miR-337-3p可与甘油-3-磷酸脱氢酶1（Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase 1，GPD1）mRNA 互补结合。有研究表明，miR-337-3p在骨关节炎中具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用［20］。miR-337-3p可能与细胞的增殖能力密切相关，可能具有促癌基因的作用。GPD1基因位于染色体12q13.12上，以往的研究认为GPD1蛋白是连接碳水化合物和脂质代谢的关键因素，其表达异常可引起三酰基甘油合成改变，在高三酰甘油血症、肝纤维化和脂肪性肝炎等疾病中发挥重要作用［21］。近年来，GPD1蛋白在肿瘤发生发展的研究成为热点。ZHOU等［22］报道，GPD1蛋白在乳腺癌组织和细胞株中呈低表达，GPD1蛋白的低表达与乳腺癌患者的不良预后明显相关，过表达GPD1可明显抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。GPD1蛋白可发挥明显的抑癌基因作用。本研究发现，转染表达FZD10-AS1的质粒可明显下调骨肉瘤细胞中miR-337-3p的表达，而miR-337-3p的表达降低能明显促进GPD1基因的表达，表明FZD10-AS1可能通过“海绵作用”下调miR-337-3p，间接促进GPD1基因的表达的表达，从而抑制骨肉瘤的增殖和迁移。上皮间质转化过程是肿瘤细胞发生转移的关键机制，即细胞的上皮细胞表型经重新编程为间充质表型［10］。本研究发现，GPD1基因表达上调后，上皮细胞表型E-cadherin表达升高，间质细胞表型ZEB-2表达降低，表明U-2OS细胞的迁移能力降低；细胞周期调控蛋白CDK7、Cyclin H的表达降低，表明U-2OS细胞增殖能力降低。本研究的不足之处在于没有在体内验证FZD10-AS1对骨肉瘤增殖和迁移的影响，这是本研究下一步研究的重点。

综上，FZD10-AS1在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞株中表达降低。在U-2OS细胞中，过表达FZD10-AS1可通过降低miR-337-3p的表达间接促进GPD1基因的表达，抑制骨肉瘤U-2OS细胞的增殖和迁移能力，对FZD10-AS1的研究对发现骨肉瘤潜在治疗靶点可能具有重要临床意义。