UPLC-QTOF-MS法研究甘油三酯作为水生环境中农药污染的潜在生物标志物

何 聿,夏 倩,王文莉,罗 芳,陈金凤,郭雅婷, 王 建,林振宇,陈国南

(1. 福州大学食品安全与生物分析教育部重点实验室, 2. 生物科学与工程学院,福州 350116; 3. 中国认证检验集团福建有限公司,福州 350116)

农业生产中广泛使用的农药会随着雨水和地表水的循环而迁移到水生环境中,并对水生生物和环境产生负面影响[1]. 由于食物链的相互联系,残留农药将通过食物链传播并迅速富集,引起食物链顶端的物种中毒,或诱发某些慢性疾病[2,3]. 迄今,科研人员已对水体中的农药污染进行了大量研究[4,5]. 如,酶抑制率法是用于农药残留快速检测最广泛使用的方法[6],但该方法准确性不佳,有时会出现误检的情况; 色谱法,包括气相色谱、液相色谱、气相色谱-质谱联用和液相色谱-质谱联用等,可简化样品纯化步骤,直接从蔬菜、水果和河水样品中提取农药残留,因此常被用于分析各类样品中的农药残留. 上述方法多为直接测定水生环境中农药残留的含量. 近年来,生物标志物开始应用于评估污染[7]. 在受污染的水生环境中,水生生物的生理机制能更敏感地反映环境变化[8,9],通过观察水生生物的生理生化反应,可以了解农药对水生环境的影响[10],从而防止过度使用农药造成严重水体污染,保护水生生物和水生环境[11]. 因此,已有越来越多的研究侧重于生物标志物的研究和生物监测技术的开发,如有机磷农药[12,13]和氨基甲酸酯农药可以抑制胆碱酯酶的活性[14],导致体内乙酰胆碱(Ach)的大量积累. 文献[15]报道,内分泌干扰物质(EDC)的混合物会影响幼年水獭的脂肪形成和脂肪沉积. 也有研究[16]表明,金属污染含量与水生生物的生理反应之间具有高度相关性. 在上述研究中,使用了差异性代谢物反应来考察污染物的环境暴露与生物学效应之间的关联性. 这些差异性代谢物具有高灵敏度,可作为农药污染的早期判断指标,也可作为水生生态系统风险评估的生物指标[17,18]. 而且,生物标记物的变化通常早于个体的表观生理变化,可作为严重污染的预警指标[19].

本文以成年雄鲫鱼为模型,采用UPLC-QTOF-MS法研究了3种不同类型的农药(敌百虫、高效氯氰菊酯和吡虫啉)对其生理代谢的影响,筛选并鉴定出TGs等差异性物质,并研究了这些差异性物质的含量变化与暴露时间和暴露浓度的关系,以发现反映污染物存在的生物标志物. 所鉴定出的TGs可在低浓度暴露2 h内产生响应,而目前关于农药对水生生物毒性的研究通常需要96 h甚至更长的时间[20].

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

乙腈和甲醇(质谱级,德国Merck公司); 甲酸(质谱级,美国ACS公司); 氢氧化钠(纯度99.99%,美国Sigma-Aldrich公司); 亮氨酸脑啡肽(美国Waters公司); 甲酸铵(纯度≥99.0%)和丁香油(C.P.级)(中国上海阿拉丁公司); 敌百虫、高效氯氰菊酯及吡虫啉均为市售产品.

Waters Acquity UPLC型液相色谱仪、Xevo G2 QTOF/MS型质谱仪和UPLC BEH HILIC型色谱柱(2.1 mm×75 mm×1.7 μm),美国Waters公司; 超纯水来自Direct-Q3 UV系统(18.2 MΩ·cm,德国Merck Millipore公司).

1.2 实验过程

1.2.1 鱼类材料 从当地市场购得新鲜鲫鱼[(300±50) g]. 实验前,在玻璃鱼缸中饲养7 d,每日定时用商业饲料喂食一次,正常光照、通氧.

1.2.2 鱼类暴露实验和样品收集 在考察暴露时间的影响时,将鲫鱼分别暴露于20 ng/mL敌百虫、20 ng/mL高效氯氰菊酯或20 ng/mL吡虫啉中,取样时间分别为0,2,4,6,8和10 h(0 h为空白对照组); 在考察浓度的影响时,将鲫鱼随机分成6组(吡虫啉浓度分别为0,1,2,5,10和20 ng/mL,0 ng/mL为空白对照组),暴露时间均为2 h. 暴露过程中无死亡.

将空白组与暴露组各抽取12个平行样本(n=12). 取样时,先用丁香酚麻醉鲫鱼,然后在冰上用消毒后的手术刀解剖,取出脑部和肝脏组织,用0.2%(体积分数)甲酸溶液冲洗血迹,在液氮中冷冻并于-80 ℃储存,备用.

1.2.3 样品前处理 将组织样品从-80 ℃冰箱中取出,解冻. 将0.1 g样品与1 mL甲酸溶液(体积分数0.2%,4 ℃)混合,用细胞破碎仪打碎得到匀浆液,加入12 mL甲酸-乙腈溶液(体积分数0.2%,4 ℃)以沉淀蛋白. 静置2 h后,冷冻离心10 min(12000 r/min,4 ℃). 用0.22 μm有机滤膜过滤上层清液,用于UPLC-QTOF-MS分析.

1.2.4 UPLC-QTOF-MS分析 超高效液相色谱分离条件: ACQUITY UPLC BEH HILIC柱(2.1 mm×75 mm×1.7 μm); 流动相A为水(含0.125% 甲酸和10 mmol/L甲酸铵); 流动相B为乙腈/甲醇/水混合溶液(体积比90∶5∶5,含0.125%甲酸和10 mmol/L甲酸铵); 流速0.3 mL/min; 柱温35 ℃; 流动相以90%B等度洗脱,5 min内完成.

质谱分析条件: 电喷雾电离源,MSE正模式,离子源温度120 ℃,辅助喷雾电离与脱溶剂气为高纯氮气,脱溶剂气温度550 ℃,脱溶剂气流速1000 L/h,锥孔反吹氮气流速50 L/h,毛细管电压1.0 kV,锥孔电压20 V,碰撞能量10～30 V,碰撞气为氩气,质量扫描范围为m/z50～1000,采用亮氨酸-脑啡肽溶液校正,采用甲酸钠溶液用于创建校准,确保仪器的准确性<0.5 mDa.

1.2.5 数据采集和生物标志物鉴定 使用Masslynx软件采集数据,所得数据用UNIFI软件分析,根据其质荷比(m/z)、保留时间(Retention time)、二级碎片信息及信号强度筛选差异代谢物[21]. 并根据上述信息在脂质数据库(http://www.lipidmaps.org)、人类代谢组数据库(http://www.hmdb.ca/)和其它开放获取数据库中进行检索,鉴定环境污染的潜在生物标志物,其中理论质量数与实际测得的质量数的质量误差阈值设置为5×10-6.

2 结果与讨论

2.1 不同农药暴露的代谢轮廓比较

应用超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-QTOF-MS)对分别暴露于敌百虫、高效氯氰菊酯和吡虫啉(20 ng/mL)中2 h的鲫鱼进行分析. 图1为3种农药暴露前后,鲫鱼脑部和肝脏组织的总离子流(TIC)图. 可见,空白对照组与暴露组样品中的代谢产物存在细微差异,随后通过UNIFI软件鉴定了差异性物质.

Fig.1 Total ion chromatograms(TIC) of brain(A) and liver tissues(B)(A1,B1) Blank; (A2,B2) exposure in trichlorfon; (A3,B3) exposure in β-cypermethrin; (A4,B4) exposure in imidacloprid.

2.2 不同暴露条件下的差异性比较

采用火山图(图2)对比分析了敌百虫暴露组(20 ng/mL,2 h)、高效氯氰菊酯暴露组(20 ng/mL,2 h)和吡虫啉暴露组(20 ng/mL,2 h)中脑部和肝脏组织的内源代谢物的变化. 可见,暴露组的脑部组织[图2(A1)～(C1)]的差异小于肝脏组织[图2(A2)～(C2)],这可能是因为肝脏作为生物体最重要的解毒器官,在低浓度农药暴露后其代谢机制的反应比脑部灵敏. 此外,由图2还可见,吡虫啉暴露组肝脏的差异最为明显. 因此,重点研究了吡虫啉暴露组的差异,以筛选不同的差异代谢物.

Fig.2 Volcano plots of endogenous metabolites(n=12,*P<0.05)(A1) Trichlorfon-treated brain; (A2) trichlorfon-treated liver; (B1) β-cypermethrin-treated brain; (B2) β-cypermethrin-treated liver; (C1) imidacloprid-treated brain; (C2) imidacloprid-treated liver.

2.3 生物标志物的筛选

使用UNIFI软件,根据质量误差≤5 mDa,保留时间误差≤0.1 min,差异倍数≥5的筛选原则,通过二元对比筛选出不同样品之间的差异性物质,并对其进行鉴定. 图3示出了吡虫啉暴露后脑部和肝脏组织的二元对比结果.

Fig.3 Binary contrast spectra of brain(A) and liver(B) tissues(A1) Base peak intensity(BPI) of brain exposed for 0 and 2 h; (A2) chromatogram of difference in brain; (A3) mass spectrum of difference in brain; (B1) BPI of liver exposed for 0 and 2 h; (B2) chromatogram of difference in liver; (B3) mass spectrum of difference in liver.

表1列出了经UNIFI软件二元对比筛选出的差异性物质. 筛查结果显示,暴露前后脑部组织中差异性物质的差异并不显著,差异倍数均小于2; 而在肝脏组织中,筛选出一系列差异性物质,其中差异物质m/z146.1175由UNIFI的代谢库中鉴定为乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach),其差异倍数为1.056,而在m/z800～1000范围内则筛选出较多差异倍数大于5的差异性物质.

以UNIFI筛选出的差异性物质m/z896.7709为例,图4(A)示出了对照组(0 h)与暴露组(2,4,6,8和10 h)中该物质的保留时间,图4(B)为对应的质谱图. 通过图4(C)所示色谱峰面积的变化考察了暴露时间对该差异性物质含量的影响,可见,其在吡虫啉暴露2 h后迅速堆积,随即开始呈下降趋势,这可能与肝脏的解毒和生物体的自我修复能力有关. 表1中差异倍数大于5的其它物质(m/z872.7726,874.7867,896.7709,898.7881和900.8013)也存在类似的变化规律. 因此推测,这些物质可能是吡虫啉暴露的潜在生物标记物.

Table 1 Information of representative components with high responses in brain and liver samplesexposed to imidacloprid(0 and 2 h)

Fig.4 Effect of exposure time on endogenous metabolite(m/z 896.7709) (A) BPI of endogenous metabolite(m/z 896.7709). Exposure time/h: a. 0; b. 2; c. 4; d. 6; e. 8; f. 10; (B) mass spectrum of endogenous metabolite(m/z 896.7709); (C) effect of exposure time on peak area of endogenous metabolite(m/z 896.7709)(n=12,*P<0.05).

2.4 生物标志物的鉴定

对上述生物标记物通过在线数据库(LMSD和HMDB)进一步鉴定. 根据误差范围内精确分子量及相应的二级碎片信息,可准确地鉴定其元素组成和结构. 表2列出了与数据库匹配的差异代谢物的信息,精确分子量误差均小于5×10-6. 由表2可知,在吡虫啉暴露组中,肝脏组织的差异代谢物主要为甘油三酯类(TGs)物质. 结合二级质谱信息可进一步确认该类物质. 图5(A)和(B)分别给出了可能生物标志物(m/z806.5728和896.7709)的二级质谱图,并将其与HMDB网站数据库中预测的二级质谱图[图5(C)和(D)]比较,结果一致. TGs由脂肪和肝脏合成而成,并储存在脂肪组织中. 生物体通过分解代谢TGs为其自身的活动提供能量[22]. 当鲫鱼暴露于农药中时,农药中毒进入生物体并影响脂质的动员过程[23,24],通过甘油三酯脂肪酶(ATGL)抑制TGs的特异性水解,导致短时间内TGs的积累[25]. 已有研究[26]表明,大部分持久性有机污染物(POPs)和其它内分泌干扰物化学物质(EDCs)均可能改变各种脂质调节水平,包括增加对肝脏胆固醇和TGs合成的刺激,且由POPs引起的脂质代谢异常早于葡萄糖代谢异常. 据文献[27]报道,吡虫啉暴露导致脂质蓄积引发肥胖以及相关疾病.

Table 2 Summary of information on different endogenous metabolites mainly lipids detected inESI positive ion mode of UPLC-QTOF-MS mass spectrometry

Fig.5 Comparison in detected MS/MS spectra and predicted MS/MS spectra in HMDB(A) Detected MS/MS spectrum of m/z 806.5728; (B) detected MS/MS spectrum of m/z 896.7709; (C) predicted MS/MS spectrum of m/z 806.5728; (D) predicted MS/MS spectrum of m/z 896.7709.

2.5 浓度依赖性实验

Fig.6 Effect of exposure concentration(n=12,*P<0.05)(A) Heatmap of the metabolites in fish liver exposed to different concentrations(0,1,2,5,10,20 ng/mL) of imidacloprid for 2 h. Each concentration is represented in columns,and each metabolites in lines. Blue indicates low content,whereas red indicates high content; (B) Michaelis Menten equation fitting curve of m/z 896.7709 change with exposure concentration.

进一步研究了不同浓度的吡虫啉对暴露的影响. 总体而言,随着吡虫啉暴露浓度的增加,大多数生物标志物均呈现出蓄积的趋势. 图6(A)的热图示出了吡虫啉暴露浓度对鲫鱼肝脏组织中不同差异性代谢物的影响. 可见,暴露浓度低于5 ng/mL时,TG(52∶4),TG(52∶3),TG(54∶6),TG(54∶5)和TG(54∶4)含量相对稳定; 当暴露浓度高于5 ng/mL时会产生蓄积. 而磷脂酰胆碱[PC(38∶6),PC(40∶7)]和Ach在考察的暴露浓度范围(0～20 ng/mL)内并没有明确的变化趋势. 可见,与Ach和PCs相比,TGs对吡虫啉暴露更为敏感. 以TG(54∶6)(m/z为896.7709)为例,其增长趋势符合Origin非线性拟合的Michaelis-Menten方程模型[图6(B)].

3 结 论

以鲫鱼为模型,采用UPLC-QTOF-MS法研究了不同农药的低浓度暴露对其生理机制的影响,并鉴定出TGs作为吡虫啉暴露的生物标记物. 研究发现,低浓度吡虫啉暴露将导致鲫鱼肝脏中TGs的蓄积,且TGs对于吡虫啉暴露响应非常灵敏,低浓度暴露2 h即可引起鲫鱼肝脏中TGs的大量堆积. 该方法比长期大剂量暴露实验更灵敏且更适用于初步检测,尤其适用于对水生环境中农药污染的早期预警.