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多形汉逊酵母提高生长性能的培养基优化

2020-03-12高教琪周雍进

生物加工过程 2020年1期
关键词:生物素丙酮酸葡萄糖

刘 爽,高教琪,薛 闯,周雍进

(1.中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连116031;2.大连理工大学生物工程学院,辽宁大连116024)

多形汉逊酵母(Ogataeapolymorpha)是目前一种应用较为广泛的甲基营养型酵母[1],其生长繁殖速度快[2]、底物利用广泛、耐受温度高[3]、易于发酵培养,适于工业发酵生产高附加值化学品[4]。早在1995年时,Weydemann等[5]在汉逊酵母菌株中表达水蛭素变异体HV1亚型,成功构建了水蛭素生产菌株O.polymorphaRB11,产量达1 g/L。目前,汉逊酵母作为宿主细胞主要应用于低级醇[6-7]、天然产物[5,8-9]以及蛋白质[10-11]的发酵生产。同时,汉逊酵母近年来越来越受到人们的关注,主要是因其具有优良的甲醇代谢能力[12]。

甲醇作为最简单的化学品之一,是十分重要的C1有机化工原料和化工基础产品[13]。甲醇最初来源于木材干馏[14],但现在的工艺已经可以利用煤炭经过气化或天然气经过蒸汽重整大规模合成,这就可避免与人争粮、与动物争粮的问题[15]。甲醇作为具有清洁特性的重要液体燃料,具有便于携带和运输的特点。因此被普遍应用于医药、农药、有机合成、染料、涂料和汽车等行业中[16]。同时,甲醇作为微生物发酵底物,可合成具有高附加值的产品,日益成为合成生物学和代谢工程领域的研究热点[17]。

但目前多形汉逊酵母发酵培养基大多使用蛋白胨和酵母粉,这就使发酵成本一直高居不下,降低发酵培养基成本是实现多形汉逊酵母大规模工业生产的一个重要前提。维生素,是维持生物机体生命活动所必需的一类有机化合物,同时也是保持机体健康生长必要的活性物质[18]。氨基酸是维持生物机体生命活动所必需的基本物质,是合成各种蛋白质的必要成分,参与机体肌肉、皮肤、脏器、酶和免疫抗体等物质的合成[19]。维生素和氨基酸虽然含量极少,却在生长、新陈代谢以及发育等过程中发挥着不可替代的作用[20]。因此,如果利用维生素和氨基酸来代替蛋白胨和酵母粉等昂贵且复杂的营养成分,在保证良好细胞生长的同时,将能够极大地降低培养基成本。

本文中,笔者从基础盐培养基出发,优化葡萄糖和甲醇2种培养基中维生素和氨基酸的种类和浓度。同时,利用单因素实验和响应面试验法,确定维生素和氨基酸成分的最少添加量,以期得到优化后的培养基来促进细胞生长,简化培养基组成,降低发酵成本,对大规模工业应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

OgataeapolymorphaNCYC495菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),编号CGMCC 2.2412。

1.2 试剂与仪器

丙酮酸脱氢酶可见分光光度法试剂盒、丙酮酸羧化酶微量法试剂盒,上海优选生物科技有限公司;甲醇、葡萄糖、琼脂粉、无水KH2PO4、各种氨基酸试剂以及各种维生素试剂,生工生物工程(上海)股份有限公司;(NH4)2SO4、MgSO4以及trace metal溶液中的各种试剂,天津市科密欧化学试剂有限公司;蛋白胨、酵母粉等,OXOID公司。其中trace metal溶液配方(pH 4.0,g/L):FeSO4·7H2O 3.0、ZnSO4·7H2O 4.5、CaCl·2H2O 4.5、MnCl2·4H2O 1.0、CoCl2·6H2O 0.3、CuSO4·5H2O 0.3、H3BO31.0、Na2MoO4·2H2O 0.4、KI 0.1、Na2EDTA·2H2O 19.0。

Macy UV-1100型紫外可见分光光度计,美析(中国)仪器有限公司;ZQZY-CF8型三层组合全温振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司;Heraeus Multifuge X1R型离心机,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;HPX-9052 MBE型电热恒温培养箱,上海博讯实业有限公司医疗仪器设备厂。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种培养

从平板中挑取单菌落至5 mL 酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基中(15 mL离心管),摇床活化24 h左右后,吸取200 μL菌液转接至20 mL YPD培养基中(100 mL锥形瓶)摇床培养16~18 h为种子液。取适量种子液于15 mL离心管内,1 000g、5 min离心,去上清,使用与种子液体积相同的基础盐培养基洗2次后,使初始OD600为0.1时接入相应培养基中,发酵体积为50 mL(250 mL锥形瓶),每组3个平行。本研究中培养温度为37 ℃,摇床转速为200 r/min。

1.3.2 培养基中维生素成分的优化

以分别添加单独的7种维生素成分的7个培养基为实验组,以添加混合维生素溶液的培养基作为阳性对照组,以不添加任何维生素成分的基础盐培养基作为空白对照组。随时间测定600 nm处的OD600作为生物量指标,判断培养基的优劣。

1.3.3 培养基中氨基酸成分的优化

以分别添加单独的10种氨基酸成分的10个培养基为实验组,以添加混合氨基酸溶液的培养基作为阳性对照组,以不添加任何氨基酸成分的基础盐培养基作为空白对照组。随时间测定600 nm处的OD600,判断培养基的优劣。

1.3.4 丙酮酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的酶活性测定

测定丙酮酸脱氢酶活性的原理:丙酮酸脱氢酶催化丙酮酸脱氢,同时将作为电子受体的2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP)还原,从而导致605 nm处光吸收A605的减少。

测定丙酮酸羧化酶活性的的原理:丙酮酸羧化酶催化丙酮酸、CO2和水在ATP的作用下生成草酰乙酸,并且将ATP分解成ADP和Pi,之后苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH发生反应,生成苹果酸和NAD+,产生的NAD+与特异的显色剂反应,产生在450 nm处最大吸收峰的黄色物质,通过检测该黄色物质在450 nm处的增加速率,即可反映丙酮酸羧化酶的活性。

1.3.5 Box-Behnken试验法优化添加浓度

Box-Behnken试验法具有可以方便有效地测试多个过程变量并且可以识别和量化多个变量之间复杂的交互作用的特点[21]。因此研究中使用此方法对同时添加的多种维生素或氨基酸之间相互作用时的最优浓度进行优化。

2 结果与讨论

2.1 优化以葡萄糖为碳源的培养基

2.1.1 优化添加的维生素的种类和浓度

首先进行单因素试验,向以葡萄糖为碳源的基础盐培养基中添加混合维生素溶液作为阳性对照组,以不添加任何其他成分的基础盐培养基为空白对照组,以分别单独添加7种维生素成分的基础盐培养基为7个实验组。

首先测定发酵至平台期时各个培养基的OD600,结果见图1(a)、(b)。由图1(a)、(b)可知:分别单独添加的7种维生素中对多形汉逊酵母在此培养基中的生长起促进作用最明显的是生物素成分;不添加任何维生素成分的葡萄糖基础盐培养基中菌种生长缓慢,发酵至80 h的OD600只能达到2.0,而添加了混合维生素溶液的培养基中的菌种发酵至平台期OD600可达到13.6,是空白对照组的近7倍;在分别单独添加各种维生素溶液的7个实验组中,对生长促进效果最明显的是生物素成分,发酵的最大OD600同样可以达到13.6,与添加混合维生素溶液的培养基相当。由此可见,只需单一生物素成分即可以明显促进多形汉逊酵母在葡萄糖基础盐培养基中的生长。

其次,对单独添加的生物素浓度进行优化。根据混合维生素溶液中生物素的浓度,选取0.005、0.025、0.050和0.100 mg/L这4个质量浓度的生物素进行单独添加,测定其生长曲线,结果见图1(c)。由图1(c)可知,4组生长曲线均在27 h左右达到了发酵平台期,最大OD600都在11~12。由此可见,添加不同浓度的生物素溶液对葡萄糖基础盐培养基中多形汉逊酵母菌种生长的促进作用几乎没有差异。因此,为了降低培养基的成本,只需选取最少量添加,即培养基中添加的生物素质量浓度为0.005 mg/L。

2.1.2 优化添加氨基酸种类和浓度

为了确定氨基酸混合溶液中10种不同氨基酸促进作用,分别在葡萄糖基础盐培养基中添加10种氨基酸成分,同时以添加氨基酸混合溶液的培养基为阳性对照组,以不添加任何氨基酸成分的基础盐培养基为空白对照组,测定发酵至平台期(115 h)时各个培养基的OD600,结果见图2。

由图2可知,天冬氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸是对多形汉逊酵母在葡萄糖培养基中的生长起促进作用的最主要的3种成分。发酵时间至115 h,不添加任何氨基酸成分的基础盐培养基中多形汉逊酵母菌株的OD600达到3左右,而添加氨基酸混合溶液的培养基的OD600能达到10。分别单独添加天冬氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸这3种成分的培养基,发酵至115 h的OD600分别能达到7.6、7.4和5.5。虽然这3种氨基酸单独添加对菌种的生长都有一定程度的促进作用,但是并不及混合氨基酸溶液的促进作用,因此决定以这3种成分的混合溶液进行添加,以提高多形汉逊酵母在以葡萄糖为碳源的基础盐培养基中的OD600。

G—Delft+葡萄糖;G+Vit—Delft+葡萄糖+维生素混合溶液;G+生物素—Delft+葡萄糖+生物素图1 优化葡萄糖培养基中添加的维生素的种类和浓度Fig.1 Optimizing the types and concentrations of vitamins added to glucose medium

G+aa— Delft+葡萄糖+氨基酸混合溶液;G+Asp—Delft+葡萄糖+天冬氨酸;G+Glu—Delft+葡萄糖+谷氨酸;G+Met—Delft+葡萄糖+甲硫氨酸图2 优化葡萄糖培养基中添加的氨基酸种类Fig.2 Optimizing the types of amino acids added to the glucose medium

进一步分别对天冬氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸这3种氨基酸的添加量进行优化,根据混合氨基酸溶液中的各成分浓度,甲硫氨酸选取5、10、20和40 mg/L这4个质量浓度;天冬氨酸和谷氨酸均选取10、50、100和200 mg/L这4个质量浓度,对分别添加上述浓度氨基酸的培养基的发酵过程测定其生长曲线,结果见图3。

G+Optimized-aa—Delft+葡萄糖+优化的氨基酸溶液图3 优化葡萄糖培养基中添加的氨基酸浓度Fig.3 Optimization of amino acid concentrations in glucose medium

由图3可知:甲硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的最佳添加量分别是40、200和200 mg/L,发酵100 h后最大OD600分别达到5.2、7.2和9.4。这些结果表明谷氨酸对多形汉逊酵母在葡萄糖培养基生长的促进最明显。将三者结合添加后,前期生长更快,菌种的生长曲线几乎与添加氨基酸混合溶液的培养基一致,发酵至平台期时,最大OD600能达9.3(图3(d))。

2.1.3 培养基综合优化

上述系列试验确定了向以葡萄糖为碳源的基础盐培养基中添加的维生素成分:0.005 mg/L的生物素,添加的氨基酸成分为40 mg/L的甲硫氨酸、200 mg/L的谷氨酸和200 mg/L的天冬氨酸。因此尝试将优化的生物素和氨基酸混合加入葡萄糖基础盐培养基中,测定其OD600,结果见图4。

由图4可知,不添加任何维生素和氨基酸成分的基础盐培养发酵至70 h的OD600为3,这与之前结果一致。添加混合维生素溶液和11种氨基酸混合溶液的培养基发酵至平台期菌种的最大OD600达到20,是空白对照组7倍。而添加优化后的生物素和3种氨基酸的培养基菌种的最大OD600也达到了20,并且优化后的培养基中多形汉逊酵母的生长曲线几乎与添加全部混合溶液的培养基中菌株的生长曲线重合。该结果表明:优化的葡萄糖培养基对多形汉逊酵母的生长促进与添加全部混合溶液的培养基一致,这样能大大简化培养基中所需要添加的成分,降低了培养基成本。因此,最终确定向以葡萄糖为碳源的基础盐培养基中添加的成分:生物素0.005 mg/L、甲硫氨酸40 mg/L、谷氨酸200 mg/L、天冬氨酸200 mg/L。

G+aa+Vit—Delft+葡萄糖+氨基酸混合溶液+维生素混合溶液;G+Optimized—Delft+葡萄糖+优化后的氨基酸和维生素溶液图4 验证优化后的葡萄糖基础盐培养基Fig.4 Verification of optimized glucose base salt medium

2.2 优化以甲醇为碳源的培养基

2.2.1 优化添加的维生素种类

进一步对以甲醇为碳源的培养基中维生素和氨基酸有效成分的优化。同样,首先进行单因素试验,探索甲醇为碳源的基础盐培养基中的关键营养成分,添加混合的维生素溶液作为阳性对照组,以不添加任何其他成分的基础盐培养基为空白对照组,以分别单独添加7种维生素成分的基础盐培养基为7个实验组,测定发酵至平台期(培养90 h)时各个培养基对应的OD600,结果见图5。

由图5可知,生物素、泛酸钙和维生素B1是对多形汉逊酵母在甲醇培养基中的生长起促进作用最明显的3种成分(图5(a))。不添加任何维生素成分的空白对照组发酵至90 h平台期时的OD600只能达到4,而添加了泛酸钙、生物素和维生素B1的这3个实验组的OD600至平台期分别达到5、6.6和6.7(图5(b))。虽然这3种维生素成分对菌种的生长有明显的促进作用,但是分别单独添加对菌种生长的促进作用还是不及添加混合维生素溶液的效果显著。因此有必要研究这3种营养成分的混合添加比例。

M—Delft+甲醇;M+Vit—Delft+甲醇+维生素混合溶液;M+生物素—Delft+甲醇+生物素;M+泛酸钙—Delft+甲醇+泛酸钙;M+VB1—Delft+甲醇+维生素B1图5 优化甲醇培养基中添加的维生素种类Fig.5 Optimizing the types of vitamins added to methanol medium

2.2.2 优化添加的维生素成分种类

采用Box-Behnken响应面试验法对添加的生物素、泛酸钙和维生素B1这3种维生素成分的浓度进行优化。使用Design-Expert 8.0.6软件对试验进行设计和分析,甲醇培养基添加3种维生素的响应面相应立体分析图如图6(a)~(c)所示。最终经过软件模拟优化后得到最优实验结果:生物素 0.005 mg/L;泛酸钙2.00 mg/L;维生素B1为1.04 mg/L,预计最终能达到的最大OD600为10.13。

对其结果进行验证,以添加优化浓度后3种维生素溶液的培养基作为实验组,以不添加任何维生素成分的甲醇基础盐培养基作为空白对照组,以添加混合维生素溶液的培养基为阳性对照组,测定3种培养基的生长曲线,结果如图6(d)所示。

由图6(d)可知,不添加其他成分的基础盐培养基的最大OD600仍然在4左右。而优化后的培养基的生长曲线几乎与添加混合维生素溶液的培养基一致,发酵至平台期时最大OD600为9.27。因此可以推定此响应面优化的结果是有效的。

2.2.3 进一步减少甲醇培养基中添加的维生素种类

为了进一步简化甲醇培养基,尝试将生物素、泛酸钙和维生素B1这3种维生素成分适当减少,考察其对生长的影响,结果见图7。

由图7可知:单独添加一种维生素溶液时,多形汉逊酵母在其培养基中的OD600没有得到明显提高;单独添加维生素B1的促进作用是最显著的但远不及添加3种维生素溶液的促进效果;添加生物素和维生素B1两种维生素溶液时,发酵至平台期的OD600为9.3,这与添加生物素、泛酸钙和维生素B1这三种维生素溶液时的OD600(9.6)十分接近,表明减少泛酸钙对OD600没有影响。进一步实验验证发现,仅添加生物素(0.005 mg/L)和维生素B1 (1.04 mg/L)能显著提高多形汉逊酵母在甲醇为碳源的培养基中的生长,且与添加混合维生素溶液的培养基中生长情况相当。因此,以甲醇为碳源的基础盐培养基中,仅仅添加生物素和维生素B1即可。

2.3 优化后的培养基结果及成本核算

经过上述一系列的研究,最终分别确定了以葡萄糖和甲醇为碳源的2种培养基,以工业级产品的每吨单价为标准对优化后培养基进行简单的成本核算,并且与添加混合溶液的基础盐培养基所需成本进行对比,结果见表1和2。

添加优化后的3种维生素的质量浓度分别为(mg/L):生物素0.005、泛酸钙2.00、维生素B1 1.04;M+Optimized—Delft+甲醇+优化的维生素图6 利用响应面法优化甲醇培养基中添加的3种维生素的浓度Fig.6 Optimization of three vitamins addition to methanol medium by response surface method

1—生物素;2—泛酸钙;3—维生素B1图7 进一步优化甲醇培养基中添加的维生素种类Fig.7 Further optimization of vitamin types added to methanol medium

由表1和2可知,优化后的葡萄糖培养基每吨的成本比添加混合维生素和混合氨基酸溶液培养基的成本少93.14元;优化后的甲醇培养基每吨的成本比添加混合维生素溶液培养基的成本少4.22元,这为以后的产业化应用降低成本。

2.4 优化后的培养基对细胞关键酶活力的促进作用

综上所述,在对多形汉逊酵母培养基的优化过

表1 葡萄糖培养基成本核算

注:各种培养基成分价格来源于网络调研(https://www.hc360.com/)。

表2 甲醇培养基成本核算

注:各种培养基成分价格来源于网络调研(https://www.hc360.com/)。

程中,笔者发现对其生长起到明显促进作用的成分是某些氨基酸(Asp、Glu和Met)和维生素成分(生物素和维生素B1)。对这种促进作用的机制进行推测:可能是细胞内某些关键酶的酶活发生了显著变化,从而加快了细胞对糖等营养物质的代谢过程,进而加快细胞生长。因此,为了证明上述推测,选取受这些营养成分调控的关键酶:丙酮酸羧化酶(PC)和丙酮酸脱氢酶(PDH),对其不同细胞生长时期的酶活性进行测定,以证实细胞生长的加快与关键酶活性的提高存在正相关。

2.4.1 优化后葡萄糖培养基中丙酮酸羧化酶活性

丙酮酸羧化酶广泛存在于酵母的线粒体中,与生物机体内补充供给草酰乙酸的反应紧密相关,是糖异生途径中第一个限速酶,与维持生命机体的血糖动态平衡密切相关。因此,丙酮酸羧化酶的活性可能加快了细胞的代谢生长,进而提高了菌体的生物量。3种氨基酸能对多形汉逊酵母的生长起到明显的促进作用的原因,是它们均进入了细胞的中心代谢,加快了细胞的代谢过程。同时推测生物素起到作用是因为它作为丙酮酸羧化酶的辅酶,提高了多形汉逊酵母细胞中丙酮酸羧化酶的活性。

对优化后葡萄糖培养基中汉逊酵母对数中期和平台期细胞的丙酮酸羧化酶的活性进行测定,结果见图8。由图8可知:在细胞对数生长中期时,不添加任何维生素成分的葡萄糖基础盐培养基中细胞的丙酮酸羧化酶的比酶活为19 U/mg,添加混合维生素和混合氨基酸溶液的葡萄糖培养基中的细胞丙酮酸羧化酶的比酶活最高,能够达到195 U/mg,是葡萄糖基础盐培养基中的10倍,而优化后的葡萄糖培养基中细胞的丙酮酸羧化酶的比酶活为37 U/mg,是葡萄糖基础盐培养基的约2倍。

2.4.2 优化后甲醇培养基中丙酮酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶活性

在以甲醇为碳源的基础盐培养基中,对多形汉逊酵母在其中的生长起到最明显促进作用的是生物素和维生素B1两种维生素成分。一方面生物素作为丙酮酸羧化酶的辅酶,与优化后的葡萄糖培养基相似,其活力的提高可能极大地促进了细胞生长过程。另一方面,维生素B1的辅酶形式硫胺素焦磷酸(TPP),是丙酮酸脱氢酶的辅酶。丙酮酸脱氢酶是丙酮酸脱氢酶复合体催化丙酮酸氧化脱羧过程中重要的限速酶。PDH催化丙酮酸脱羧生成羟乙基-TPP,进而合成乙酰辅酶A,将糖酵解途径与三羧酸循环途径连接起来。因此,在甲醇培养基中添加维生素B1成分可提高细胞中丙酮酸脱氢酶的活性,促进细胞中TCA循环的进行,进一步提高了菌体的生物量。

为了验证上面的推测,同样对在以甲醇为碳源的基础盐培养基中生长的多形汉逊酵母对数中期和平台期细胞中的丙酮酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的活性进行测定,结果见图8。

由图8可知:在细胞对数生长中期时,不添加任何维生素成分的甲醇基础盐培养基中细胞的丙酮酸脱氢酶的比酶活为102 U/mg (以1 mg蛋白计),添加混合维生素溶液的甲醇培养基中的细胞丙酮酸脱氢酶的比酶活达到130 U/mg,而优化后的甲醇培养基中细胞的丙酮酸脱氢酶的比酶活最高,能达到450 U/mg,超过甲醇基础盐培养基中的4倍。这些结果表明维生素B1的添加显著提高了丙酮酸脱氢酶活性,从而促进了细胞生长。

*表示差异显著(0.01

在细胞对数生长中期时,不添加任何维生素成分的甲醇基础盐培养基中细胞的丙酮酸羧化酶的比酶活为9 U/mg,添加混合维生素溶液的细胞丙酮酸羧化酶的比酶活达到26 U/mg,而优化后的甲醇培养基中细胞的丙酮酸羧化酶的比酶活达到82 U/mg,是甲醇基础盐培养基中的9.1倍。这些结果表明生物素的添加确实提高了丙酮酸羧化酶活性。

3 结论

通过单因素和响应面实验分别确定了以甲醇和葡萄糖为碳源的培养基的最终成分。在促进多形汉逊酵母细胞生长的同时,降低了发酵培养基组分及成本,为后续的大规模工业化生产提供了参考。

当以甲醇为碳源时,培养基组成为(NH4)2SO42.5 g/L、KH2PO414.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L(营养缺陷型添加)、甲醇10 g/L、生物素0.005 mg/L、维生素B1 1.04 mg/L,优化后每吨培养基能节省4.22元。与未添加的基础培养基相比,OD600提高了2.5倍。优化后的甲醇培养基细胞中丙酮酸脱氢酶酶比酶活提高3倍以上,丙酮酸羧化酶比酶活也提高了8倍左右。

当以葡萄糖为碳源时,培养基组成为(NH4)2SO42.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO414.4 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L、葡萄糖 20 g/L、生物素 0.005 mg/L、甲硫氨酸 40 mg/L、谷氨酸 200 mg/L、天冬氨酸 200 mg/L,优化后每吨培养基节省成本93.14元。与未添加的基础培养基相比,细胞生长提高了7倍以上。优化后的葡萄糖培养基细胞中丙酮酸羧化酶比酶活提高了1倍。

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