钩吻配伍玉叶金花对大鼠脏器组织病理形态改变及扭体镇痛实验研究

高汉云，王翠雪，黄宇如，杨策，王英豪

(1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.北京预立创投生物科技有限公司，北京 100000)

钩吻是马钱科植物胡蔓藤(GelsemiumelegansBenth.)的全草，又名断肠草、毒根等，毒性巨大。其主要分布于我国的福建、浙江、广东、云南、贵州等地，广泛分布于亚洲东南地区[1]。《神农本草经》中记载，钩吻性温，味辛、苦，有大毒。具有祛风散瘀、消肿止痛、攻毒杀虫的作用。药理作用及有害毒性的产生主要来源生物碱类中吲哚类或氧化吲哚类等[2]。钩吻具有镇痛、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用，但是由于钩吻本身具有的毒性，限制了其在临床上的广泛应用[3]。在钩吻减毒方法的研究中，黄美霞等[4]研究发现通过赤芝双向固体的发酵可以减缓的钩吻毒性；李德森等[5]证实羊血、鸭血、猪血能解钩吻毒性也是客观性存在，认为其可能与其凝血酶有关；吴水生等[6]研究表明钩吻经过砂炒炮制后毒性也有明显的降低，同时镇痛药效又保留存在。而中药配伍减毒也是最常用的减毒方法，中药通过合理的配伍调其偏性，制其毒性，即可减轻药物的毒性又可增强药效，使中药用药更加安全。

玉叶金花是茜草科植物玉叶金花(MussaendapubescensAit.f.)的干燥茎叶，又名山甘草、凉口茶、白纸扇等，主要分布在广东、广西、福建等地。其性凉，味甘、微苦，具有清热解暑，凉血解毒的功效，可用于预防中暑，治疗感冒、支气管炎等疾病。《福建药物志》《广西中药材标准》《中药大辞典》等文献中有记载，玉叶金花能解钩吻之毒，并保留钩吻镇痛药效。本研究据此展开实验，旨在探讨玉叶金花减弱钩吻毒性的作用机制，使钩吻更加安全地应用于临床，同时也为钩吻相畏减毒存效的理论提供实验依据[7]。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级KM种小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体重18～22 g；SPF级SD大鼠，雄性，体重200～220 g，由福建中医药大学动物中心提供，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：沪2012-002，饲养于实验动物中心SPF级实验室[许可证号：SCXK(闽)2014-0005]，实验动物饲养环境温度(24±0.5)℃,昼夜明暗交替时间为12 h/12 h,湿度45%～50%,标准饲料和水供动物自由饮食。

1.2 药品与试剂 玉叶金花购自福建省福州市闽侯县，经福建中医药大学药学院黄泽豪教授鉴定为茜草科植物玉叶金花(MussaendapubescensAit.f.)的干燥茎叶；钩吻购自福建省龙岩市胡蔓藤种植基地，经福建中医药大学药学院黄泽豪教授鉴定为马钱科植物胡蔓藤(GelsemiumelegansBenth.)的全株。

石油醚(上海泰坦科技股份有限公司)；二氯甲烷(上海泰坦科技股份有限公司)；乙酸乙酯(上海泰坦科技股份有限公司)；无水乙醇(上海泰坦科技股份有限公司)；苦味酸(广东六山化工厂)；多聚甲醛粉末(国药集团化学试剂有限公司)；二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)；苏木素-伊红染色液(索莱宝科技公司)；中性树脂(迈新生物技术公司)；吲哚美辛片(临汾奇林药业有限公司)。

1.3 实验仪器 中草药粉碎机(FY135，天津市泰斯特仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-S，上海锦屏仪器仪表有限公司)；旋转蒸发仪(RE-52，上海亚荣生化仪器厂)；纯水器(MILLI-Q，美国Milipore公司)；低温冰箱(Forma-86c ULT Freezer，美国Thermo公司)；超声波清洗器(KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司)；循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司)；低温冷却循环泵(DLSB-5/20，郑州长城科工贸有限公司)；石蜡切片机(RM2015，德国莱卡)，生物组织包埋机(YB-6LF，湖北孝感亚光医用电子公司)；生物组织脱水机(ZT-14S，湖北孝感亚光医用电子公司)；干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；显微镜(DM4000B，德国莱卡)；电子天平(FA2004N，上海精密科学仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 药物的制备 精密称取适量钩吻药材，加入5倍量90%乙醇，浸泡30 min后，回流提取1 h，提取2次，合并上清液并减压回收浓缩，定容至钩吻提取液浓度为0.05 g·mL-1后，加入3倍量二氯甲烷萃取钩吻提取液，萃取3次，合并萃取液，减压回收浓缩即得钩吻二氯甲烷部位，4 ℃保存备用。

精密称取适量玉叶金花药材，加入5倍量90%乙醇，浸泡30 min后，回流提取1 h，提取2次，合并上清并减压回收浓缩，定容至玉叶金花提取液浓度为2.0 g·mL-1后分别用3倍量石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取玉叶金花提取液，萃取3次，弃去萃取液，收取水部位，减压回收浓缩即得玉叶金花水部位，4 ℃保存备用。

2.2 减毒作用实验 将30只SPF级SD大鼠，称重后按体重均衡原则分为空白对照组、钩吻组(0.36 g·kg-1)、钩吻与玉叶金花配伍组(0.36 g·kg-1+14.4 g·kg-1)，每组灌胃给予相应的药物溶液7.2 mL·kg-1，空白组给予等体积的生理盐水，每天1次，连续7 d。最后一次给药后1 h，迅速取出大鼠心、肝、脾、肺、肾，放入预冷的生理盐水中冲洗，滤纸吸干动物组织表面的液体，放入4%的多聚甲醛中固定。大鼠组织经4%多聚甲醛固定48 h后，组织脱水，石蜡包埋制成10 μm切片，再经组织脱蜡，最后苏木精-伊红(HE)染色。

2.3 扭体实验 将40只KM种小鼠，雌雄各半，随机分成4组，每组10只。苦味酸标记、小鼠称重记录。模型组、吲哚美辛组(0.01 g·kg-1)、钩吻组(0.27 g·kg-1)、钩吻与玉叶金花配伍组(0.27 g·kg-1+ 7.12 g·kg-1)分别给药，各组灌胃给予相应的药物溶液5.4 mL·kg-1，30 min后腹腔注射0.6%醋酸溶液10 mL·kg-1。观察并记录小鼠注射醋酸溶液后15 min内出现扭体反应(伸展后肢、腹部收缩内凹、臀部抬高)的次数，扭体潜伏时间，按下式计算镇痛率。

镇痛率=(对照组扭体次数-给药组扭体次数)/对照组扭体次数×100%

3 实验结果

3.1 对组织病理形态改变的影响

3.1.1 肺组织HE染色 如图1所示，空白组肺组织结构正常，未见病理性改变；钩吻组与空白组相比，肺泡间隔明显增宽，部分肺泡腔呈实变状并且充有大量炎性细胞；而钩吻与玉叶金花配伍组显示肺组织结构趋于正常，仅有局部少量细胞壁稍显增厚，炎性细胞浸润明显减少。

图1 大鼠肺组织药物毒理切片(HE×200)

3.1.2 脾组织HE染色 如图2所示，空白组可见脾小体结构清晰，脾脏结构正常；钩吻组可见脾脏皮质内有多量含棕褐色色素的巨噬细胞并可见巨核细胞，高倍镜下显示充有多量红细胞；钩吻与玉叶金花配伍组显示脾脏结构接近正常，脾小体结构未见明显改变。

图2 大鼠脾组织药物毒理切片(HE×400)

3.1.3 肝组织HE染色 如图3所示，空白组肝细胞结构正常，以中央静脉为中心，单行排列成板状结构；与空白组比较明显可见钩吻组有多量炎性细胞浸润，肝小叶内个别肝细胞坏死，核固缩；钩吻与玉叶金花配伍组可见，肝细胞结构接近空白组基本接近正常，门管区无炎性细胞。

图3 大鼠肝组织药物毒理切片(HE×400)

3.1.4 肾组织HE染色 如图4所示，空白组大鼠肾小球囊腔清晰可见，肾组织结构正常，没有明显变化；钩吻组肾小球毛细血管数目较正常组减少，球囊腔扩张，并且肾小球局部多量炎性细胞浸润；钩吻与玉叶金花配伍组肾小球囊腔清晰，肾小球局部仅有少量炎性细胞浸润，并且炎性细胞数量明显减少。

图4 大鼠肾组织药物毒理切片(HE×400)

3.1.5 心组织HE染色 如图5所示，空白组大鼠心肌结构正常，横纹清晰，核居中，间质为少量血管及结缔组织；钩吻组与空白组相较，心肌间质增宽，局部小灶性心肌细胞变性，少量炎性细胞浸润；钩吻与玉叶金花配伍组心肌结构接近空白组，心肌结构基本正常。

图5 大鼠心组织药物毒理切片(HE×200)

3.2 对扭体实验的影响 结果见表1。与模型组比较，吲哚美辛组、钩吻组及钩吻与玉叶金花配伍组均能显著减少15 min内醋酸所致的小鼠扭体次数(P<0.01)，扭体潜伏时间也明显延长。与吲哚美辛组比较，钩吻组及其配伍组的扭体次数差异不明显，无统计学差异，钩吻组及其配伍组的镇痛作用差异不明显，提示钩吻配伍后仍保留显著镇痛作用。

表1 醋酸扭体试验结果

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与吲哚美辛组比较，#P<0.05

4 讨论与结论

钩吻主要成分为吲哚类生物碱，其中含量最高是钩吻素子(koumine)，其次为钩吻素甲(geliemine)、钩吻素寅(kouminicine)。钩吻中的生物碱毒性与烟碱、毒蕈碱类似，具有强烈的神经毒性，会抑制延髓呼吸中枢、脑和脊髓的运动中枢，导致呼吸肌麻痹，最终出现呼吸衰竭[8-9]。钩吻的药理作用及有害毒性产生均来源生物碱类中吲哚类或氧化吲哚类等[10]。现代研究证明，钩吻具有镇痛、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用。其中镇痛作用在前期也有研究证实在多种实验性疼痛模型上钩吻素子有明显抗慢性疼痛的药理作用，如外周神经损伤所致的神经病理性疼痛、内脏平滑肌痉挛引起的绞痛、慢性炎性疼痛和癌症剧痛等，且治疗指数较高。说明了钩吻素子发挥的镇痛药理作用有着潜在的研究价值。镇痛药在目前临床应用较多的是阿片类，其这类药物的成瘾性极大，使得临床上的应用有所限制。而钩吻镇痛不存在成瘾性及身体精神依赖性成了研究的热点。但是，钩吻在临床应用中常发生中毒事件，吲哚类生物碱既是其主要活性成分，又是毒性成分。因此，如何减毒是钩吻安全应用需解决的关键问题[11]。

前期研究证实玉叶金花有减缓钩吻毒性的作用[12-14]，本实验亦观察到钩吻组给药30～120 min内，大鼠会逐渐出现发抖、四肢无力以及表现出运动失调状态，进而兴奋并伴有痉挛，继而出现间歇性的惊厥、跳跃，最后呼吸衰竭死亡。而正常组活动如常；钩吻与玉叶金花配伍组大鼠给药30～120 min内，异常状况明显减轻。故针对配伍后的钩吻毒性降低进一步探讨在病理形态上的改变及镇痛效果。有研究表明确定其钩吻素子致小鼠的半数致死量后，对其心、肝、肾作病理观察时，病理形态发生改变最严重首先出现在肺，肺萎陷导致呼吸面积减少，肺通气肺换气不足，二氧化碳不能排除而发生呼吸性酸中毒。其次酸中毒会使心机氧化酶受到抑制，心肌的纤维性颗粒明显改变，肌原纤维和横纹肌模糊，使得心肌收缩力的减弱，心排血量降低，血管紧张性也降低，血压的下降，血液循环障碍。由于血液循环障碍，肝脏参与合成解毒功能降低，肝受到损害，引起肝细胞发生变性，肝小叶中央部位和外周的肝细胞脂肪变性；血液循环障碍又可导致肾脏的重吸收和排泄障碍，引起肾脏的变性等。脾、肺脏器作病理观察时可有大量瘀血出现，脏器的黏膜出现充血、肿胀等[15]。

本研究通过HE染色法观察钩吻与玉叶金花配伍后对大鼠组织病理改变的影响，结果显示钩吻与玉叶金花配伍抗炎作用显著，能显著降低钩吻毒性。通过醋酸扭体法疼痛模型来探讨钩吻的镇痛效果，结果显示钩吻与玉叶金花配伍后对醋酸扭体法引起的小鼠疼痛反应有明显抑制作用，小鼠的疼痛阈显著提高，镇痛作用明显。综上所述，钩吻与玉叶金花配伍具有减毒存效的作用，玉叶金花可减缓钩吻的毒性，具有抑制炎症的作用。

本研究揭示了钩吻与玉叶金花配伍在减毒的同时保留了镇痛疗效，其结果对钩吻在临床应用上更加明确，同时也为钩吻与玉叶金花配伍减毒机制进一步研究做了指导。如今，细胞信号传导通路是一个研究热点，医学工作者对疼痛的认识已近深入到细胞分子甚至基因水平，而中药对细胞通路的研究也逐渐受到国内外研究者的重视。因此，要系统阐述钩吻与玉叶金花配伍的减毒机制，还有待于做更深入、更全面的研究，对钩吻在临床应用上进一步发展具有重要意义。