产气荚膜梭菌实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法的建立和比较

刘立兵，李睿文，陈志敏，王金凤，孙晓霞，袁万哲,*，王建昌,*

（1.石家庄海关，河北 石家庄 050051；2.河北省检验检疫科学技术研究院，河北 石家庄 050051；3.河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），又称为魏氏梭菌（Clostridiumwelchii），是一种革兰氏阳性厌氧菌，也是一种人兽共患病病原体[1]。根据产气荚膜梭菌分泌的α、β、ε、ι四种主要毒素，可以将之分为A、B、C、D和E型[2-3]。不同型的产气荚膜梭菌可以导致不同的疾病，均具有发病急、死亡率高等特点[4]。产气荚膜梭菌广泛分布在土壤、污水等自然环境中，引起的食物中毒事件在我国非常严重，摄入被产气荚膜梭菌污染的食物后，能够引起恶心、腹泻等临床症状，从而引发肌坏死性疾病[5]；羔羊、仔猪、牛犊、雏鸡等动物感染产气荚膜梭菌，会导致坏死性肠炎、肠毒血症等疾病[6]。产气荚膜梭菌污染给人类健康和畜牧业健康发展造成了巨大的危害，因此对产气荚膜梭菌的快速检测对于疫病防控和食品安全保障具有重要意义。

目前，针对产气荚膜梭菌的传统检测方法主要有分离培养、细胞素方法、卵磷脂水解实验和反向间接乳凝胶结实验等[7-9]，存在检测周期长、技术要求高、过程繁琐等不足。随着分子生物学技术的发展，一系列针对产气荚膜梭菌的新方法被建立并得到了广泛应用。孙佳芝等[10]建立了灵敏度为4.57 μg/L的双抗夹心酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测方法；鲍长磊[11]建立了产气荚膜梭菌不同毒素型多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和α毒素抗体ELISA检测方法；石玉玲等[12]根据16S rRNA基因建立了实时荧光PCR方法，灵敏度则为9h102CFU/mL；刘哲等[13]建立了特异性检测产气荚膜梭菌的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法，灵敏度为2.92h102CFU/mL。ELISA方法检测灵敏度不高，试剂盒价格昂贵，且需要特异性设备；LAMP方法需要4～6 条引物，设计复杂，且极易造成假阳性结果[14]。因此，建立一种反应快速、操作简便、灵敏性高的检测方法对于产气荚膜梭菌的有效控制依然具有重要意义。

聚合酶重组酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一种等温扩增技术，主要依赖于重组酶、具有聚合链置换功能的DNA聚合酶、单链结合蛋白3 种核心蛋白实现对靶基因的等温扩增[15]。在反应过程中，重组酶结合引物形成蛋白-DNA混合物并启动寻找模板DNA上的同源序列。同源序列定位后，则会引发链置换反应，引物结合到对应模板上，具有链置换功能的DNA聚合酶进而从引物3’末端开始启动DNA合成，实现对靶基因的指数级扩增[9]。RPA能够在37～42 ℃恒温条件下20 min内完成对靶基因的有效扩增，特别适用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域，目前已经被广泛应用于多种食源性致病菌的快速检测[16-18]。

本研究根据编码A～E型产气荚膜梭菌α毒素的plc基因的高度保守区域，设计特异性引物和探针，建立实时荧光PCR和实时荧光RPA方法，并使用人工污染样品对两种方法进行验证和比较，以期为食品中产气荚膜梭菌的快速检测提供有效技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用菌种见表1。

表1 实验菌株Table 1 Bacterial strains used in this study

胰胨亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂、液体硫乙醇酸盐培养基、0.1%蛋白胨水 北京陆桥技术股份有限责任公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；Premix ExTaq宝生物工程（大连）有限公司；TwistAmpTMexokit 英国TwistDx公司。

1.2 仪器与设备

7 5 0 0实时荧光P C R仪 美国A B I公司；Genie III等温扩增荧光检测系统 英国OptiGene公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度计 美国Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计

参考GenBank中登录的产气荚膜梭菌plc基因（登录号：NC_008261.1），比对确定特异性保守序列，设计特异性引物和探针。所有引物探针均由生工生物工程（上海）有限公司合成，序列信息见表2。

表2 实验所用引物及探针Table 2 Primers and probes used in real-time RPA and real-time PCR

1.3.2 基因组DNA的提取

将产气荚膜梭菌（ATCC 13124）接种到液体硫乙醇酸盐培养基培养基中，37 ℃厌氧培养20 h。取纯培养菌液1 mL，加入到1.5 mL离心管中，11 500 r/min离心1 min，收集沉淀。采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，使用NanoDrop 2000 C超微量分光光度计测定浓度，-20 ℃保存备用。

1.3.3 实时荧光RPA方法的建立

以1.3.2节制备的产气荚膜梭菌DNA为模板，采用引物RPA-F/R和exo探针，使用TwistAmpTMexokit配制实时RPA反应体系（50 μL）：RPA-F/R（10 μmol/L）各2.1 μL，exo探针（10 μmol/L）0.6 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12.2 μL，将其混匀，加入到装有冻干酶制剂的反应管中，吹吸至完全溶解，再加入2.5 μL 280 mmol/L MgAc，盖紧管盖，瞬时离心并涡旋后，放入Genie III中，39 ℃反应20 min。在扩增过程实时收集检测荧光信号，目的基因扩增后荧光信号会明显增加。

1.3.4 实时荧光 PCR方法的建立

以1.3.2节制备的产气荚膜梭菌DNA为模板，采用引物PCR-F/R和探针TaqMan Probe建立实时荧光PCR体系为（25 μL）：Premix ExTaq12.5 μL，PCR-F/R（10 μmol/L）各1.0 μL，PCR-Probe（10 μmol/L）1 μL，DNA模板1 μL，补水至25 μL。将上述体系充分振荡混匀后，瞬时离心，放入7500实时荧光PCR仪中，反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸35 s，40 个循环，60 ℃收集荧光信号。

1.3.5 特异性和灵敏度实验

以表1所示菌株DNA为模板，根据1.3.3节和1.3.4节建立的方法进行检测，分析实时荧光RPA和实时荧光PCR方法的特异性。

提取1 mL纯培养产气荚膜梭菌的基因组DNA，并测定其浓度，进行10 倍倍比稀释，以不同稀释度的基因组DNA作为模板，根据1.3.3节和1.3.4节建立的方法进行检测，分析比较实时荧光RPA和实时荧光PCR方法的灵敏度。

1.3.6 对人工污染样品的检测比较

使用经GB 4789.13ü2012《食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》检测确定不含产气荚膜梭菌的奶粉、鸡肉、牛肉和羊肉样品，分别取25 g加入到225 mL灭菌的0.1%蛋白胨水中，拍打均匀。取出9 mL样品均液，加入一定浓度的产气荚膜梭菌纯培养液，使之浓度为1.0h106CFU/mL。拍打混匀，取1 mL人工污染产气荚膜梭菌的样品均液，用未污染产气荚膜梭菌的样品均液进行10 倍倍比稀释，每个稀释度分别取1 mL进行核酸提取，并以之作为模板分别通过实时荧光RPA和实时荧光PCR方法进行检测。同时取各个稀释的样品菌液按照GB 4789.13ü2012方法进行平板计数，将3 种方法的检测结果进行比较。

2 结果与分析

2.1 实时荧光RPA和实时荧光PCR方法的特异性

通过建立的实时荧光RPA和实时荧光PCR方法，分别以产气荚膜梭菌基因组DNA和表1中的其他细菌基因组DNA为模板，进行特异性实验分析。表3表明，两种方法仅产气荚膜梭菌有特异性扩增曲线，而其他菌株均无扩增曲线。上述结果表明建立的实时荧光RPA和实时荧光PCR方法均具有良好的特异性。

表3 实时荧光RPA和实时荧光PCR方法特异性分析Table 3 Speci fi cities of real-time RPA and real-time PCR assays

2.2 实时荧光RPA和实时荧光PCR的灵敏度

图1 产气荚膜梭菌实时荧光RPA（A）和实时荧光PCR（B）方法的敏感性Fig. 1 Sensitivities of real-time RPA (A) and real-time PCR (B) for C. perfringens detection

测定所提取的产气荚膜梭菌基因组D N A为1.3h105pg/μL，将其10 倍倍比稀释至1.3h10-1pg/μL，分别进行实时荧光RPA和实时荧光PCR检测。结果表明，实时荧光RPA和实时荧光PCR方法的检出限一致，均为1.3 pg/μL（图1）。

2.3 人工污染样品检测结果

对于人工污染产气荚膜梭菌的奶粉、鸡肉、牛肉和羊肉样品，每个稀释度取1 mL模拟污染液，提取核酸，分别进行实时荧光RPA和实时荧光PCR方法检测，与按照国家标准（GB 4789.13ü2012）的检测进行对比分析。结果表明，实时荧光RPA和实时荧光PCR方法的最低检出限均为1.0h102CFU/mL，与标准GB 4789.13ü2012检测方法的灵敏度一致（表4）。实时荧光RPA能够在20 min内完成检测，仅需要3～13 min即可实现对所有阳性样品的检测，而实时荧光PCR完成整个反应则需要55 min左右，需要24～46 min（Ct值为17.45～33.65）实现对阳性样品的检测。实时荧光RPA方法在阳性样品的确认时间上明显优于实时荧光PCR方法，而在标准检测中，需要在36 ℃进行20～24 h的增菌，在检测时间方面较前两种方法更长。

表4 人工污染样品检测结果Table 4 Results of detection of artificially contaminated samples

3 讨 论

食源性致病菌是影响食品安全的重要因素之一。由产气荚膜梭菌引起的食物中毒报道事件逐年上升，对人类的健康造成了严重影响。建立一种快速、特异、精准的产气荚膜梭菌检测方法，对人类的健康和畜牧业的发展有重要意义。本研究采用实时荧光RPA技术检测产气荚膜梭菌。实时荧光RPA反应是基于RPA反应体系中加入exo探针，扩增过程中产生的荧光信号通过荧光检测仪实现实时检测，作为一种等温扩增技术，它具有特异性强、灵敏性高、反应快速等优点，在细菌检测方面、病毒检测等方面应用广泛[19-23]。实时荧光PCR是PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，通过标准曲线对未知模板进行分析的技术，该技术以其特异性强、灵敏度高等优点，在食源性致病菌检测[12,24-25]、转基因产品检测[26]，以及致病性钩端螺旋体[27]和兔热病杆菌检测[28]中都得到广泛的应用。

plc基因编码的α毒素是产气荚膜梭菌的主要外毒素，存在于A～E型产气荚膜梭菌中，是导致畜禽坏死性肠炎、肠毒血症、气性坏疽等疾病的主要致死因素，其毒性最强，是国内外研究产气荚膜梭菌最多的毒素[29-30]。本研究根据plc基因设计特异性的引物和探针，建立的实时荧光RPA和实时荧光PCR方法对产气荚膜梭菌具有很好的特异性，不同类型的标准株和分离株均得到了特异性扩增。对于人工污染样品，两种方法的最低检出限均为1.0h102CFU/g，但实时荧光RPA方法的检测时间（20 min）明显少于实时荧光PCR方法（55 min），极大地缩短了实际样品的检测周期，更适合于实际样品的快速检测。

本研究使用Genie III实时荧光RPA运行设备，大小为25 cmh16.5 cmh8.5 cm，质量仅为1.75 kg左右，具有体积小、便携式的特点，而且适用锂电池充电工作，可以维持设备24 h的运行，非常适合实验设备相对落后的基层检测部门，以及食源性疫情的现场检测，为产气荚膜梭菌的快速现场诊断提供了有效的技术手段。