基于三重四极杆复合线性离子阱质谱法筛查和确证水产品中多种抗生素残留

孟 勇，王 静，朱晓华，耿雪冰，杨 总，沈美芳,*

（1.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017；2.江苏省水产质量检测中心，农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心（南京），江苏 南京 210017；3. SCIEX亚太应用中心，上海 201206）

近年来，随着我国水产养殖品种的多元化，养殖规模的集约化，再加上品质、种质以及渔业环境恶化等因素的影响，致使各种水产养殖病害的发生率日趋严重，因此为控制水产养殖过程中疫病的发生，药物的使用已变成常规的养殖辅助手段。目前我国水产养殖常用的抗菌药物有喹诺酮类、磺胺类、四环素类等，都是广谱抗菌药，几乎对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、某些支原体和衣原体等都具有较强的抑菌作用[1-3]。但由于水产养殖的特殊性及缺乏相应的科学指导，养殖业者在水产养殖过程中为保证药效常常超量或者违规使用药物，药物品种越来越复杂，对水产品中药物残留筛查和确诊技术的要求也越来越高。

目前，国内外对水产品中抗生素残留的研究日趋重视，检测方法主要有酶联免疫法[4-6]、液相色谱法[7-9]、液相色谱-串联质谱法[10-13]、高分辨质谱等[14-15]。酶联免疫法具有操作简便、检测成本低等优点，但定量不够准确，容易出现假阳性。液相色谱法具有分析效率高、定量准确等优点，由于抗生素药物种类繁多和样品基质的复杂性，其在多种药物的同时筛查和药物的定性方面具有一定的局限性。高分辨质谱因为其质量数准确，定性能力强，但该仪器定量能力弱，价格相对昂贵，普及率较低。本研究应用液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱技术，采用分段时间多反应监测、信息关联采集、增强子离子扫描、谱库检索的检测模式[16-18]。其原理是根据各个化合物的保留时间，在其设定的时间窗口内，当多反应监测信号超过设定的阈值时，多反应监测和增强子离子扫描会同时触发，得到该化合物的二级质谱碎片的全谱信息。并且实现了在优于常规三重四极杆液相色谱-质谱联用仪利用2 对子离子的采集信息进行定性定量的基础上，结合建立的增强子离子扫描谱库对比功能，对可疑色谱峰通过二级谱库检索进一步确证。目前水产品中药物残留的筛查和确证方法主要还是利用高分辨质谱检测技术[19-21]，但是基于三重四极杆复合线性离子阱质谱法针对水产品残留确证技术的报道很少[22]。因此，本方法拟实现同时对水产品中喹诺酮类、磺胺类、四环素类等多种抗生素残留进行快速筛查和确证，为保障我国水产品质量安全和风险监测提供有效手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 德国Merck公司；乙酸铵、甲酸、乙酸（均为色谱纯） 美国ROE公司；乙二胺四乙酸二钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；土霉素、金霉素、四环素、氘代恩诺沙星、氘代磺胺邻二甲氧嘧啶、氘代土霉素标准品 德国Dr.Ehrenstorfer公司；喹诺酮类（16 种）和磺胺类（19 种）标准品（质量浓度为100 mg/L，纯度均大于98.3%） 天津阿尔塔科技有限公司；实验用水为Millipore系统超纯水。

1.2 仪器与设备

QTRAP 4500液相色谱-质谱联用仪 美国SCIEX公司；T18匀浆机 德国IKA公司；AllegraTM离心机美国Beckman公司；Turbo Vap浓缩工作站 瑞典Biotage公司。

1.3 方法

1.3.1 混合标准溶液配制

粉末状标准品均用甲醇配制成100 mg/L的标准储备液。从质量浓度为100 mg/L的标准储备液中各取100 μL，用甲醇定容至10 mL，制备质量浓度为1.0 mg/L的混合标准储备液，于-18 ℃保存备用。实验中再用0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液作为溶剂，逐级稀释，配制成不同质量浓度的混合标准使用液待用。

氘代恩诺沙星、氘代磺胺邻二甲氧嘧啶、氘代土霉素标准品分别用1.0%甲酸-甲醇溶液配制成100 mg/L的内标储备液。从上述质量浓度为100 mg/L的内标储备液中各取100 μL，用0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液作为溶剂，制备质量浓度为1.0 mg/L的混合内标溶液。

1.3.2 样品前处理

称取2.0 g均质样品于50 mL离心管中，加入1.0 mg/L混合内标溶液50 μL，涡旋混合30 s，避光放置5 min。再加入10 mL 1%甲酸-乙腈溶液和0.1 g乙二胺四乙酸二钠，涡旋振荡1 min，超声提取3 min，8 000 r/m离心5 min，取上清液。残渣中加入10 mL 1%甲酸-乙腈溶液，并用玻璃棒捣碎，重复提取1 次，合并2 次提取液，摇匀备用。提取液于40 ℃氮气条件下吹干，残渣用1 mL的0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液溶解，涡旋振荡30 s，加入2 mL正己烷，涡旋振荡30 s，4 000 r/min离心5 min，移取下层溶液于1.5 mL高速离心管中，12 000 r/min离心5 min，取上清液经0.22 μm滤膜后上机测定。

1.3.3 液相色谱-质谱条件

表1 多种抗生素和3 种内标化合物质谱条件参数Table 1 Mass spectrometric parameters for multiple antibiotics and three internal standards

Agilent Poroshell EC-C18色谱柱（100 mmh2.1 mm，2.7 μm）；流动相为0.1%甲酸溶液（A）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B）；柱温35 ℃；流速0.3 mL/min；进样量10 μL。梯度洗脱程序：0～1 min，97% A；1～2 min，97%～85% A；2～9 min，85%～75% A；9～15 min，75%～45%A；15～16 min，45%～97% A；16～20 min，97% A。电喷雾离子源正离子模式；多反应监测-信息关联采集-增强离子扫描检测模式；离子化电压5 500 V；离子源温度500 ℃；气帘气压力0.21 MPa；雾化气压力0.41 MPa；辅助加热气压力0.41 MPa。具体质谱参数见表1。

1.4 数据处理

采用SigmaPlot 11.0处理数据统计及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

目前磺胺类、喹诺酮类、四环素类药物的提取剂主要有：乙腈[23]溶液、三氯乙酸溶液[24]、甲醇溶液[25]、磷酸盐缓冲液[26]等。本实验考察提取溶剂种类、提取方式、提取用量等因素对提取效果的影响，结果发现乙腈作为提取剂具有较好提取效果和去蛋白特性，也更有利于后续的净化处理，优于其他提取剂。质谱检测时采用正离子模式，因此加入适当的酸性溶液有助于提取分析物的电离和提取，但四环素类药物的回收率偏低，不足40%。参考相关文献[12]，使用1%甲酸-乙腈溶液作为提取液，加入0.1 g乙二胺四乙酸二钠，四环素类化合物的回收率明显增加，其他化合物的回收率在70%～110%之间，从而保证了所有分析目标物的提取效率。

样品净化主要方式有液液萃取[11]、QuEChERS[14]、固相萃取[13,26]、分散固相萃取[27]等。本实验加入了QuEChERS常用的无水NaSO4或无水MgSO4等净化剂，可能是因为化合物的水溶性或者产生的放热反应，对部分抗生素特别是喹诺酮类和四环素类化合物的回收率有较大影响。喹诺酮和磺胺类药物结构中含有羧基、碱性氮原子或氨基，显示出酸碱两性。HLB固相萃取柱是亲水-亲脂平衡型柱，对极性和非极性化合物均有很好的保留，在兽药残留检测中得到广泛应用[29]，但固相萃取操作过程较为繁琐、耗时长、成本较高，批次间实验结果重复性较差。因为本方法的仪器检测条件对分析目标物具有很高的特异性选择，检测图谱中较少杂质峰干扰，正己烷去脂能够满足检测要求，从而降低了检测成本，缩短了前处理时间。

2.2 色谱条件优化

比较Cortecs C18（100 mmh3.0 mm，2.7 μm）、Kinetex C18（100 mmh2.1 mm，2.6 μm）和Agilent Poroshell EC-C18（100 mmh2.1 mm，2.7 μm）3 种色谱柱分离多种抗生素的分离效果。结果表明，3 种色谱柱均能将38 种抗生素化合物分离，但Cortecs C18各色谱峰出峰时间较长，最迟出峰的氟甲喹峰形拖尾较为严重，四环素类抗生素在Agilent Poroshell EC-C18色谱柱的响应值相对更高，各分析目标物分离效率高，稳定性好，色谱峰形优异。

分别比较甲醇和乙腈作为本实验流动相的有机相对各分析目标物的分离效果影响。结果表明甲醇作为流动相时，离子化效率要优于乙腈，相应值更高，但乙腈的基线噪音要优于甲醇，分析目标物的灵敏度相对更高。因此，相较而言本实验选择乙腈作为强洗脱流动相。

本实验分别选取水-乙腈、0.1%甲酸-乙腈溶液、含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸铵-乙腈溶液、含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵-乙腈溶液作为流动相，比较不同流动相体系的洗脱效果。结果表明甲酸能够增加各种化合物在电喷雾离子源正离子模式下的离子化效率，峰形对称尖锐；乙酸铵虽然能够增加部分化合物的离子化效率，但是峰形变宽，质谱图中部分色谱峰会出现毛刺；甲酸铵会造成部分化合物分离效果不佳，后出峰的化合物拖尾严重，保留时间延长。故选择0.1%甲酸-乙腈溶液作为流动相。

2.3 质谱条件优化

在正离子模式下，38 种抗生素及3 种内标均可获得较高的[M+H]+准分子离子峰[29]。本实验分别通过对各化合物碰撞选择离子、碰撞能量和去簇电压等质谱参数进行优化，选取经碰撞后丰度较高的2 个子离子作为定量和定性离子，最终选择确定的扫描时间窗口、母离子、子离子和碰撞能量等参数（表1）。磺胺间二甲氧嘧啶和磺胺邻二甲氧嘧啶作为同分异构体，在本实验的检测条件下能够完全相互分离，保留时间分别为9.96 min和6.89 min。按优化条件进行测定，见图1。

图1 质量浓度均为20 μg/L的38 种抗生素混合标准溶液在多反应监测模式下的总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatogram for a mixed standard solution of the 38 antibiotics (20 μg/L) in MRM mode

王志杰等[11]研究33 种喹诺酮和磺胺类药物残留检测以及郭萌萌等[12]研究的23 种渔药残留检测等渔药多残留分析液相色谱-质谱联用技术，均采用常规的多反应监测模式扫描，因为监测的化合物较多，为保证每个化合物色谱峰采集的点数足够，分配的驻留时间设定非常小。通常情况下，每个色谱峰需要采集12 个点，才能使其具有良好的峰形和重复性，驻留时间对化合物的峰形影响很大[30]。在实际检测过程中存在水产品各种复杂基质的干扰，由于驻留时间很短，往往很难保证化合物能够采集足够的点数，保证检测结果的准确定性和定量。因此，本实验采用多反应监测-信息关联采集-增强子离子及分段时间扫描模式，利用每种化合物保留时间分别确定每个化合物的扫描窗口，在设定的扫描窗口只监测该化合物的定性、定量离子，从而保证每个化合物所分配的扫描窗口得到足够驻留时间。同时当多反应监测信号超过设定的阈值时，Q3会自动切换为线性离子阱，并对该多反应监测通道执行增强子离子，获得二级质谱图，从而对多反应监测的检测判定予以补充。

2.4 化合物谱库的建立及检索

常规的串联四极杆质谱只能得到多反应监测的2 对离子的色谱峰，定性和定量仅靠两对离子的丰度比确定。本实验采用三重四极杆复合线性离子阱质谱仪，并采用多反应监测-信息关联采集-增强子离子扫描模式，在多反应监测的基础上还可以采集增强型二级质谱图。另外，该谱库是开放性的，可以在原有谱库的基础上，采集高、中、低（50、40、30 eV）3 种碰撞能量下添加标样后的实际样品二级质谱图，从而对样品基质条件下的增强子离子图进行补充，提高匹配率。本方法实现了一次进样，可以同时得到多反应监测的色谱图和高灵敏度的增强子离子图，并能够通过保留时间、定量离子、辅助定性离子及二级质谱谱库的增强子离子谱库比对进行定性、定量分析，相较于常规三重四极杆液相色谱-质谱联用仪的检测，可有效降低假阳性或假阴性样品结果。

2.5 方法学验证

取质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/L一系列混合标准溶液按1.3.3节方法上机测定，以目标物的质量浓度x（μg/L）为横坐标，定量离子和相应内标离子峰面积的比值y为纵坐标绘制工作曲线。结果显示，恩诺沙星等16 种喹诺酮类化合物的线性范围为1.0～200.0 μg/L；磺胺嘧啶等19 种磺胺类化合物的线性范围为1.0～200.0 μg/L；四环素等3 种四环素类化合物的线性范围为2.0～200.0 μg/L，所有化合物的线性相关系数均大于0.99。以3 倍信噪比确定化合物的检出限。选用阴性草鱼作为空白基质，分别添加3 个质量浓度水平的加标样品，其中最低添加量为方法定量限，每个水平做6 个平行样品，按照1.3.2节进行样品前处理、以1.3.3节测定条件进行检测，结果见表2。结果表明38 种抗生素在3 个不同添加水平的平均回收率为63.5%～117.3%，相对标准偏差为2.6%～14.8%，检出限为0.5～2.0 μg/kg，定量限为1.0～5.0 μg/kg。

表2 多种抗生素的检出限、回收率和相对标准偏差（n=6）Table 2 Limits of detection, recoveries and relative standard deviations of multiple antibiotics (n= 6)

2.6 实际水产品中38 种抗生素残留的分析检测结果

将该方法用于池塘和湖泊养殖河蟹、草鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲈鱼、鲢鱼、斑点叉尾鮰、乌鳢、鳜鱼、克氏原螯虾、南美白对虾等13 个品种289 个样品中抗生素的快速筛查分析。结果发现有10 个草鱼、8 个鲤鱼、7 个鲫鱼、5 个鲈鱼、2 个乌鳢、2 个克氏原螯虾、2 个斑点叉尾鮰共36 个样品筛查出含有恩诺沙星残留；3 个鲈鱼、2 个草鱼、2 个鲫鱼、1 个乌鳢共8 个样品筛查出含有环丙沙星残留；1 个鲫鱼、1 个鳊鱼筛查出含有氧氟沙星残留，1 个鲫鱼筛查出含有磺胺间甲氧嘧啶残留；2 个鳊鱼分别筛查出含有磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶。

以上结果中有2 个喹诺酮类阳性可疑样品，通过查看未知化合物增强型二级全扫谱图，并与谱库中的二级全扫谱库进行匹配，结果见图2、表3。可疑的草鱼样品中恩诺沙星正向匹配率为88.91%，反相匹配率为89.23%，平均匹配率为84.72%。另一个可疑克氏原螯虾样品中恩诺沙星正向匹配率为90.0%，反相匹配率为45.1%，平均匹配率为40.3%。分析原因是克氏原螯虾的基质成分和谱库中的基质成分有所差异，造成了反相匹配率较低，因此通过在克氏原螯虾空白样本中添加标准溶液，采集其相关数据添加到谱库后重新进行匹配，反相匹配率提高为89.7%，平均匹配率为85.1%。

图2 阳性可疑样品的增强子离子扫描谱图（A）与谱库中的恩诺沙星标准谱图（B）的对比Fig. 2 Comparison of EPI spectrum of a doubtful positive sample (A)and the library spectrum of enrof l oxacin (B)

表3 阳性可疑样品的增强子离子扫描与谱库匹配及低匹配度筛选结果Table 3 Results of searching for EPI chromatogram of a doubtful positive sample in the library

3 结 论

本实验采用三重四极杆复合线性离子肼质谱法建立水产品中38 种抗生素的筛查与鉴定方法，结合实验室自建的二级全扫谱库可对阳性可疑样品进行鉴定。通过分段时间多反应监测-信息关联采集-增强子离子扫描的检测模式，一次进样即可同时得到多反应监测色谱图和高灵敏度的二级碎片质谱图，通过谱库检索排除假阳性或假阴性结果，相较于常规的渔药多残留液相色谱-质谱联用仪采用多反应监测检测技术，更加具有优势。综上所述，该方法分析速度快、灵敏度高、筛查范围广，适用于水产品中抗生素残留的筛查与鉴定，为满足实验室进行日常检验和风险监测提供了一种有力的技术手段。