NaOH处理对霞多丽葡萄籽原花青素的影响

张 杰，王文雅,*，袁其朋*

（1.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029；2.北京化工大学厦门北化生物产业研究院有限公司，福建 厦门 361022）

葡萄籽是红酒产业的主要副产物之一，含有较多活性物质，如维生素、矿物质、脂类、蛋白质、碳水化合物、多酚等，其中最著名是原花青素（procyanidin，PC）。来源于葡萄籽的PC有很好的药理学功能，如抗氧化性、抗炎性和广谱抗菌性等[1]。PC的上述生理学活性使其在制药、食品、医疗保健等领域应用广泛。黄烷-3-醇（儿茶素（catechin，C）/表儿茶素（epicatechin，EC））和其衍生物（表儿茶素没食子酸酯（epicatechin 3-O-gallate， ECG））为葡萄籽中PC的主要聚合单元，它们通过CüC键聚合成B型的PC[2-3]。研究发现葡萄籽中65% PC的聚合度（degree of polymerization，DP）大于5[3]，生物利用率研究显示，仅DP小于5的PC能被人体吸收[4-7]。虽然PC有很好的生物活性，但多数大分子PC不能被人吸收，因此将高聚原花青素（polymeric procyanidins，PPC）（DP＞5）转化为能被人吸收的低聚原花青素（oligomeric procyanidins，OPC）（DP＜5）或单体是葡萄籽高附加值利用的重要途经之一。

目前，国内外PC解聚的方法主要有单体链断裂剂法[8]、弱酸法[3]、酸式盐法[9]、催化剂加氢裂解法[10]、碱裂解法[11]等。这些解聚方法中，部分方法或由于生产成本高，或对设备要求苛刻，或者易产生有毒刺激性气体，不适用于食品工业生产。碱裂解法最早被应用于蔓越莓中制备A型PC，结果显示二聚体增加了8.4 倍，单体增加14.9 倍，综合评价碱法表现出了较高的工业应用潜力，但碱法对葡萄籽中B型PC制备的影响及活性研究鲜见报道。因此，本实验研究不同条件NaOH处理对葡萄籽中提取B型PC制备的影响，包括PC的平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）、PC含量、体外抗氧化活性、OPC组分的变化等，并且探究PC含量和体外抗氧化活性的关系。研究确定碱法对于葡萄籽中B型PPC有解聚和促进OPC释放的作用，并且确定最佳水解条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

法国霞多丽葡萄籽（酒厂） 西安昊轩生物科技有限公司；葡萄籽PC（纯度95%） 西安瑞林生物科技有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒 碧云天生物技术公司；福林-酚试剂、标准品C 美国Sigma公司；NaOH（分析级） 北京化工厂；乙酸（色谱级） 天津赛孚瑞科技有限公司；乙腈、甲醇（色谱级） 赛默飞世尔科技有限公司。

标准品EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2成都曼思特生物科技有限公司；原花青素二聚体B3、原花青素三聚体C1上海源叶科技有限公司；原花青素四聚体A2北京大道正行科技发展有限公司；2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；香草醛、苄硫醇、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate，DPPH） 上海麦克林生化科技有限公司。以上标准品纯度均大于96%。

1.2 仪器与设备

MS-H-ProT加热磁力搅拌器 美国赛洛捷克有限公司；V-5100B紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；LC-20AT液相色谱仪 日本岛津公司；Seven2Go高级单通道便携式pH计 梅特勒-托利多国际贸易有限公司；50 mL NEST刻度尖底离心管 北京科华经纬科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 霞多丽葡萄籽预处理

参考Gu Liwei等[12]的方法，略有修改。葡萄籽洗净，冷冻干燥48 h，粉碎过20 目筛。称粉碎后葡萄籽50.00 g，置于500 mL烧杯中，加入250 mL正己烷，300 r/min磁力搅拌脱脂12 h，静置30 min，抽滤得滤渣，置于通风橱中，静置24 h。上述实验操作尽量在避光条件下进行。

1.3.2 碱预处理及PC粗提液制备

参考文献[11-12]的方法，略有修改。脱脂葡萄籽0.500 0 g，置于50 mL离心管中。加入5 mL NaOH溶液，NaOH溶液浓度分别为0、1、2、4、6 mol/L，处理温度分别为40、60、80 ℃，处理时间分别为15、30、60 min。处理结束后，将离心管置于冰浴中至调pH值，用4 mol/L HCl溶液调节pH值至6～7，加入丙酮-水-乙酸（70∶29.5∶0.5，V/V）溶液，将离心管溶液稀释至35 mL。稀释后的处理液37 ℃水浴超声10 min。随后，室温遮光，600 r/min搅拌提取50 min，9 000 r/min离心15 min，收集上清液即获得PC粗提液，粗提液备测。在此基础上，设定温度和时间为60 ℃、15 min，NaOH溶液浓度分别为8、10、15、20、25 mol/L，按照前述流程进一步优化碱裂解条件，提取PC备测。

1.3.3 PC粗提液的除盐液制备

参考Li Zheng等[10]的方法，用乙酸乙酯萃取去除粗提液中的盐分。取5.00 mL PC粗提液于25 mL鸡心瓶中，45 ℃旋干，用15 mL超纯水溶解固体洗涤鸡心瓶，转移至125 mL分液漏斗。加30 mL乙酸乙酯，萃取3 次，收集乙酸乙酯相。取72 mL乙酸乙酯相于100 mL鸡心瓶中，45 ℃旋干。用4 mL甲醇溶解洗涤鸡心瓶，过0.45 μm滤膜，滤液备测。

1.3.4 PC的mDP测定

各称10.00 mg C、EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B3置于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，定容得1 mg/mL标准品溶液。C、EC、ECG为末端单元对照直接进行液相色谱测定，原花青素二聚体作为延伸单元的对照进行硫解实验。通过硫解原花青素二聚体B1和原花青素二聚体B3，鉴定C末端及3,4-反-表儿茶素苄硫醚、3,4-反-儿茶素苄硫醚和3,4-顺-儿茶素苄硫醚[13]。

硫解的方法参考文献[2,12,14-15]，采用反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）略有改动。各取50 µL甲醇和原花青素二聚体B1及原花青素二聚体B3溶液分别置于250 µL内插管中，加入50 µL体积分数3.3% HCl-甲醇溶液和100 µL体积分数5%苄硫醇-甲醇溶液，然后将置于1.5 mL的液相小瓶中的内插管盖紧，40 ℃水浴30 min，-20 ℃保存10 h。甲醇组为溶剂对照组，PC粗提液及除盐液按照上述操作硫解，硫解产物采用液相色谱检测。

HPLC测定条件参考Gu Liwei等[15]的方法。Diamonsil-C18色谱柱（250 mmh4.6 mm，5 µm）；柱温35 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20 µL；检测波长280 nm；流动相A为2%乙酸溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱：0～45 min，15%～80% B；45～50 min，80% B；50～55 min，80%～15% B；55～70 min，15% B。mDP按式（1）计算：

式中：末端单元分别为C、EC、ECG；延伸单元苄硫醚分别为3,4-反-儿茶素苄硫醚、表没食子儿茶素苄硫醚、3,4-顺-儿茶素苄硫醚、3,4-反-表儿茶素苄硫醚、表儿茶素-3-O-没食子酸酯苄基硫醚。

1.3.5 正相高效液相色谱（normal-phase high performance liquid chromatography，NP-HPLC）分析OPC组分

各称10.00 mg C、EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2、原花青素二聚体B3、原花青素三聚体C1、原花青素四聚体A2置于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解固体，定容得1 mg/mL标准品溶液，过0.45 µm滤膜，备测。各取1 mL 1 mg/mL的C、EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2、原花青素二聚体B3溶液于10 mL带塞螺纹玻璃管，混合均匀得混合标准品1。同样配制混合标准品2（C、EC、ECG）、混合标准品3（原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2、原花青素二聚体B3）、混合标准品4（C、EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2、原花青素二聚体B3、原花青素三聚体C1、原花青素四聚体A2），-20 ℃贮存备测。

HPLC条件参考Choy等[16]的方法，略有改动。Develosil diol 100色谱柱（250 mmh4.6 mm，5 µm）；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20 µL；检测波长280 nm；流动相A为乙腈-乙酸溶液（98∶2，V/V），流动相B为甲醇-超纯水-乙酸溶液（95∶3∶2，V/V）；梯度洗脱：0～3 min，7% B；3～53 min，7%～37.6% B；53～56 min，37.6%～100% B；56～69 min，100% B；69～75 min，100%～7% B；75～85 min，7% B。参考文献[16]的液相色谱测定条件对DP大于10的PC检测有干扰，因此将流动相A改为乙腈-水（98∶2，V/V），其他测定条件同上。

1.3.6 PC含量的测定

参考Çam等[17]的方法，略有修改。称25.00 mg C置于25 mL容量瓶，加入适量甲醇溶解C，定容得100 µg/mL母液。分别取1、2、4、6、8 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得10、20、40、60、80 µg/mL梯度溶液。取1.00 mL待测液于10 mL试管中，加2.50 mL质量分数1%香草醛-甲醇溶液，加2.50 mL体积分数25% H2SO4-甲醇溶液，30 ℃水浴15 min，于波长500 nm处测吸光度，甲醇作空白对照。以吸光度为纵坐标，以C质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.008 1x+0.068（R2=0.999 8）。除盐液稀释8 倍，进行测定，根据方程计算，结果以C当量表示（µg/mL），以干基计。

1.3.7 体外抗氧化测定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力测定

参考Xu Changmou等[18]的方法，略有修改。称6.26 mg Trolox置于25 mL容量瓶，加入适量甲醇溶解Trolox，定容得1 000 µmol/L母液。分别各取1、2、4、6、8 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得100、200、400、600、800 µmol/L Trolox溶液。取100 µL待测液于10 mL试管，加入3.90 mL 2.5 mg/100 mL DPPH-甲醇溶液。空白组为甲醇，于波长515 nm处测得吸光度A0。对照组在30 ℃黑暗条件下反应60 min，于波长515 nm处测定吸光度A。DPPH自由基清除率按式（2）计算。以清除率为纵坐标，以Trolox为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.055x+0.976 2（R2=0.999 6）。除盐液稀释8 倍后，进行测定，根据方程计算，结果以Trolox当量（µmol/g）表示，以干基计。

1.3.7.2 Fe3+还原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定

参考相关文献[19-20]的方法，略有改动。称量12.52 mg Trolox置于50 mL容量瓶，加入适量超纯水溶解，定容得2 000 µmol/L母液。分别取0.5、2.5、5、7.5 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得150、300、600、900、1 200、1 500 µmol/L Trolox溶液。取试剂盒中TPTZ稀释液、TPTZ溶液和检测缓冲液以10∶1∶1比例混匀，37 ℃孵育60 min得FRAP工作液。取180 µL FRAP工作液加入到96 孔板中，加入5 µL待测样品混匀，37 ℃孵育5 min，于波长593 nm处测定吸光度，超纯水作空白对照。以还原产物吸光度为纵坐标，Trolox为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.000 6x-0.027 7（R2=0.998 3）。除盐液稀释8 倍后，进行测定，根据方程计算，结果以Trolox当量（µmol/g）表示，以干基计。

1.3.7.3 ABTS阳离子自由基清除能力测定

参考相关文献[19,21]的方法，略有改动。取100 mL 7 mmol/L ABTS溶液和50 mL 2.45 mmol/L K2S2O8溶液置于250 mL蓝色螺纹瓶，25 ℃黑暗条件下反应12 h，得ABTS反应初始液。用乙醇稀释ABTS反应初始液于波长734 nm处测定吸光度为0.700f0.200。称12.52 mg Trolox置于50 mL容量瓶，加入适量甲醇溶解，定容得2 000 µmol/L母液。分别取0.5、2.5、5、7.5 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得100、500、1 000、1 500 µmol/L溶液。取30 µL待测液于10 mL试管中，加入3.00 mL ABTS-甲醇溶液，30 ℃反应6 min，在734 nm波长处测定吸光度A，空白组为乙醇溶液A0。清除率计算同式（2）。以ABTS阳离子自由基清除率为纵坐标，以Trolox为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.000 4x-0.024 8（R2=0.995 9）。除盐液稀释8 倍后，进行测定，根据方程计算，结果以Trolox当量表示（µmol/g），以干基计。

1.3.8 PPC的制备

参考Saucier等[22]的方法，略有改动。制备文献[22]中报道的mDP较高的组分F1。称2.00 g 95%葡萄籽PC于200 mL容量瓶，加入适量超纯水溶解，定容得10 g/L母液。取50 mL的母液置于250 mL的分液漏斗中，加入100 mL乙酸乙酯萃取，萃取3 次，收集水相。将水相置于100 mL鸡心瓶中，45 ℃旋干。加入25 mL的甲醇重新溶解和洗涤鸡心瓶，并将液体转移至100 mL离心管中，加入25 mL氯仿，混合均匀后静置30 min。将液体分别置于2 个50 mL离心管中，10 000 r/min离心15 min。弃上清液，收集固体，加少许甲醇溶解，将溶液置于100 mL鸡心瓶，45 ℃旋干，得50.00 mg PPC固体。

称10.00 mg PPC，置于10 mL容量瓶，加入适量甲醇溶解，定容得1 mg/mL PPC，过0.45 μm滤膜，备测。进行硫解实验，测定PPC的mDP。

中和反应会生成较多NaCl引起柱子堵塞，因此选取低浓度2 mol/L NaOH溶液进行研究。称20.00 mg PPC于50 mL离心管中，加入1 cm转子，加20 mL 2 mol/L的NaOH溶液，60 ℃、200 r/min水浴15 min。然后将离心管冰浴，200 r/min持续搅拌，用4 mol/L HCl溶液调节pH值至6～7。取15 mL粗反应液按照1.3.3节步骤除盐得除盐液，过0.45 μm滤膜，备测。

1.4 数据处理

所有实验重复3 次，采用Origin 2017处理数据并作图，结果以fs表示。用One-way ANOVA分析显著性差异，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 NaOH处理条件对PC的mDP的影响

图1 RP-HPLC检测除盐液样品、聚合终端标准品、聚合延伸单元（二聚体硫解）色谱图Fig. 1 RP-HPLC analysis of desalted sample, polymerization terminal standard, polymerization extension unit (dimer thiolysis)

图2 NaOH处理对PC mDP的影响Fig. 2 Effect of different NaOH pretreatments on the mDP of procyanidins

如图1A所示，分离出9 个峰，其他样品出峰相似。图1B～G为PC末端单元及延伸单元的出峰时间，与Gu Liwei等[12]结果一致。其中峰5和峰8对应的表没食子儿茶素苄硫醚和表儿茶素-3-O-没食子酸酯苄基硫醚无标准品，只能根据相关文献出峰时间及顺序鉴定[12,14-15,23-24]。由图2A可知，粗提液组中经NaOH处理的实验组与NaOH浓度为0 mol/L的对照组相比，整体mDP均显著降低，说明温度、时间及NaOH浓度都会影响mDP，可推测NaOH对PC可能有解聚的作用。但粗提液中含NaCl较多会堵塞液相色谱柱，因此后续检测需进行除盐处理。由图2B可知，与粗提液相比，除盐液的mDP稳定在1.2～2.5之间，十分接近。

2.2 NaOH处理条件对PC及体外活性的影响

2.2.1 液相色谱测定条件的优化

图3 液相色谱条件优化Fig. 3 Optimization of mobile phase composition

目前用于葡萄籽PC检测的方法有MonoChrom Diol[25]和Develosil Diol[16,26-28]。Develosil Diol能测DP 1～10及DP大于10的PC，MonoChrom Diol能测DP 1～5及DP大于5的PC，为更准确地表征PC，本研究采用Develosil Diol对PC的DP进行测定。首先进行单体和二聚体混合标准品检测的优化，从图3A可以看出，将乙腈-乙酸（98∶2，V/V）作为流动相条件下，在60 min出现一个非目标大峰，为减少非目标因素的干扰，对流动相进行优化，流动相改为乙腈-水（98∶2，V/V）；调整后的结果如图3B所示，60 min大峰减小，说明干扰减小。在此基础上，使用新的流动相体系对C、EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2、原花青素二聚体B3、原花青素三聚体C1、原花青素四聚体A2单标和混标进行检测，结果显示，分子质量相同的单体混合仅出现一个峰；分子质量不同的混标，按照分子质量大小，分子质量小的先出峰，分子质量大的后出峰；混标各单体的出峰时间与单标的出峰时间有差异，但差异较小（图3C～M）。这说明乙腈-水（98∶2，V/V）为较优的流动相，能够用于后期葡萄籽OPC制备物的鉴定。

2.2.2 NP-HPLC测定OPC组分及OPC含量

图4 样品的NP-HPLC分析Fig. 4 NP-HPLC analysis of crude and desalted samples

图5 碱处理样品的液相色谱分析及OPC含量的变化Fig. 5 Effect of NaOH concentration on OPC contents as a function of pretreatment temperature

生物利用率研究显示，OPC是被人体吸收的主要PC组分。因此，研究碱对PC的解聚效果需要重点分析产物中OPC含量的变化。依据DP小于5混标的出峰时间，可以对OPC的组分进行分析（图3M）。图4分别为60 ℃，15 min，NaOH浓度分别为0、1、2、4、6 mol/L粗提液和除盐液的液相色谱图，OPC的组成和含量有明显的变化，其中粗提液中10～15 min出现了一个明显的大峰（图4A），但在除盐液中却没有（图4B），可以推测这个未知峰对应的化合物不溶于乙酸乙酯，可能是杂质，因此不再进一步分析。图4B中25 min后基本没有出峰，也说明除盐后样品中的主要PC为OPC。由图5A～I可知，OPC各组分占比为单体＞二聚体＞ECG＞三聚体＞四聚体，四聚体较少。以下除特殊说明，对照组均为0 mol/L NaOH。

考察处理时间15、30、60 min对OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量的影响发现（图5A～C），随着时间的延长，对照组OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量变化不大，而实验组OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量均呈减小趋势。研究温度40、60、80 ℃对OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量的影响发现（图5A、D、G），随着温度的升高，对照组的OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量变化不大，实验组除1 mol/L碱处理外，OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量均呈现增加趋势，其中6 mol/L表现最优，而80 ℃结果最差。

NaOH浓度变化对OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量的影响显示，与对照组相比，1 mol/L时单峰面积小于对照，大于1 mol/L时峰面积均大于对照，且随着NaOH浓度的增加而增加；OPC组分的总峰面积及OPC含量的变化与单体峰面积变化相似，且进一步增加NaOH浓度仍有可能增加OPC组分、总峰面积及OPC含量（图5）。

综合处理时间、处理温度、NaOH浓度3 个因素分析，当6 mol/L NaOH溶液处理15 min时，对比处理温度40、60、80 ℃的数据发现，80 ℃和60 ℃较高，且80 ℃的OPC总峰面积和OPC含量高于60 ℃，依次分别为10 265 300.00f10 750.08，（72.96f2.60）μg/mL和9 878 310.00f15 417.32，（60.25f1.84） μg/mL，但60 ℃时有3 种PC：单体7 332 290.00f7 846.53、ECG 672 790.33f1 149.17和二聚体1 873 230.00f6 690.29，而80 ℃仅有2 种PC：单体8 023 860.00f7 010.10和二聚体2 241 460.00f4 675.69。苏惠娟[29]尝试4 种碱解聚PPC，解聚效果为氢氧化钠＞碳酸钠＞碳酸氢钠≈碳酸氢钾，最佳解聚条件为60 ℃、1 mol/L NaOH溶液处理25 min，得单体15.6 mg/g，二聚体20.1 mg/g，与本研究解聚产物相似。

2.2.3 NaOH处理样品体外抗氧化活性

图6 不同碱处理样品的体外抗氧化活性及体外活性与PC含量的相关性分析Fig. 6 In vitro antioxidant activities of different alkali-treated samples and their correlation with PC content

由图6所示，当温度和时间一定时，与对照组相比，1 mol/L NaOH处理样品的抗氧化活性小于对照，大于1 mol/L时活性均大于对照，且随着NaOH浓度的增加而增加。当温度和NaOH浓度一定时，活性随着时间的延长而降低。当时间和NaOH浓度一定时，随着温度的变化，活性的变化无规律。6 mol/L NaOH处理15 min，对比不同温度发现，DPPH、FRAP、ABTS抗氧化实验结果均表现为60 ℃时活性最高，分别为（967.40f14.69）、（856.72f10.046 19）、（1 331.17f12.38） μmol/g。综上分析，60 ℃条件下，6 mol/L NaOH处理15 min，获得的OPC活性最高，OPC组成分析结果显示，该条件下获得OPC富含ECG组分（图5D）。Zhang Shuting等[30]的研究结果与本研究相似，且其研究指出ECG的活性高于C和EC。故ECG组分含量较高可能是60 ℃、6 mol/L NaOH处理15 min后，OPC活性最大的原因。

2.2.4 最优碱处理条件

6 mol/L NaOH、60 ℃碱处理15 min时，OPC组分的总峰面积、OPC含量及体外抗氧化活性均呈增加趋势（图6），推测进一步增加NaOH浓度仍可以增加OPC组分的总峰面积、OPC含量及体外抗氧化活性。25 ℃时，饱和NaOH浓度为26.4 mol/L，因此进一步研究8、10、15、20、25 mol/L NaOH对PC解聚的影响。由图7A可知，粗提液mDP在10 mol/L NaOH处理时降至最低，随着NaOH浓度的增加又呈缓慢增加；而除盐液的mDP较平稳地维持在1.29f0.019～2.51f0.017。图7B～D显示，除盐液的OPC总峰面积与PC含量均在10 mol/L NaOH处理时达最大值，DPPH、FRAP、ABTS 3 种方法对于除盐液抗氧化活性检测均显示在10 mol/L NaOH处理时达最高值。且PC含量与DPPH、FRAP、ABTS抗氧化活性均表现良好的线性关系。综上，最佳预处理条件为60 ℃、15 min、10 mol/L NaOH。在此条件下，与对照组相比，mDP由5.39f0.12降至1.30f0.014，OPC组分的总面积增加了7.28 倍（单体8.09 倍，二聚体7.53 倍，三聚体4.66 倍），OPC含量增加了5.42 倍，体外抗氧化活性DPPH、FRAP、ABTS分别提高3.22、4.13 倍和2.84 倍。

图7 NaOH浓度对PC的影响Fig. 7 Effect of different NaOH concentrations on mDP and total area and content of OPC and correlation between antioxidant activities and OPC content

2.2.5 碱处理对葡萄籽中PC释放和解聚的规律

图8 碱处理对PC解聚的影响Fig. 8 Effect of alkali treatment on depolymerization of procyanidins

依据2.2.4节分析NaOH浓度0～25 mol/L，60 ℃碱处理15 min对OPC组分及OPC含量的影响，发现碱对葡萄籽中的PC可能存在2 种作用：首先根据OPC含量先降低后增加的趋势分析，碱可以促进OPC释放。其次根据液相结果分析单体、ECG、二聚体、三聚体等对应的峰面积都有或多或少的增加，其中单体占比最高，增加最显著，可以推测碱对PPC可能存在解聚作用。这与相关报道[31-32]的酚酸在植物中的2 种存在状态（游离态和结合态）一致。随着NaOH浓度提高，OPC含量先增加后减少的规律也支持本实验推测的可能性（图7B）。图8A对NaOH浓度影响葡萄籽中游离和结合的OPC含量变化的机制进行了解释：对照组没有碱的作用，游离层的OPC可以被丙酮混合液提取。1 mol/L NaOH处理时，碱对结合层作用很小，不足以破坏其结构或与其成分发生反应，NaOH则会与部分游离层释放的OPC反应破坏其结构。当2～10 mol/L NaOH处理时，随着NaOH浓度的增加，结合层被逐渐破坏瓦解，随着结构破坏的加剧更多的OPC被释放，同时也有更多OPC与碱反应，但释放大于损失。在10 mol/L NaOH处理时，释放远大于损失，故溶液中OPC最多。当10～25 mol/L NaOH处理时，结合层释放的OPC在10 mol/L NaOH时已达到最大值，随着NaOH浓度的增加，OPC损失加剧，损失逐渐大于最大释放量，故溶液中能检测到的OPC越来越少。0～25 mol/L NaOH，60 ℃处理15 min时检测结果显示，碱对OPC组分有明显增加作用（图7B）。进一步PPC碱处理，如图8B所示，碱处理使60 min单峰变为在3～20 min的系列小峰，而图3M显示在此时间段内出现的单峰为单体、ECG、二聚体、三聚体，说明碱对PPC存在解聚作用，此结果与White等[11]的研究结果一致。上述这些结果说明了碱对葡萄籽中的OPC存在释放和解聚制备2 种作用机制，二者的动态平衡显示为最终OPC的产量。

3 结 论

通过探究不同NaOH浓度条件对葡萄籽PC的mDP、OPC组分、OPC含量以及体外抗氧化活性的影响，发现碱对于PC的释放及解聚均有作用，并且得到了最优条件为60 ℃、15 min、10 mol/L NaOH处理。与对照组相比，优化处理条件下PC的mDP由5.39f0.12降至1.30f0.014，OPC组分的总面积增加7.28 倍（单体8.09 倍、二聚体7.53 倍、三聚体4.66 倍），OPC含量增加（5.42f0.56）倍，体外抗氧化活性DPPH、FRAP、ABTS分别提高3.22、4.13、2.84 倍。