探讨Foxa2基因表达对小鼠心脏房间隔缺损的影响

张 猛，武玉华，孙晓栋，潘金勇 (石河子大学医学院第一附属医院儿科，新疆 石河子 832008)

德朗热综合征(Cornelia de Lange Syndrome,CdLS)是一种表现为多系统发育障碍的遗传性疾病，据相关研究目前认为该疾病主要与常染色体显性遗传以及X-连锁两种遗传方式，通常会表现为生长发育的障碍、上肢及手部畸形、精神发育迟滞、行为的异常以及心脏间隔的缺损。在总人群中发病率为1∶10 000，该疾病的发生对患者的生活质量以及家庭的经济负担造成严重影响。2004年Tonkin等发现Nipped-B相似基因(Nipped-B-like，NIPBL)突变可导致常染色体显性遗传CdLS[1]，Kawauch等人报道了NIPBL+/-携带单倍体NIPBL基因的转基因小鼠。在E17.5-E18.5，有接近一半NIPBL+/-胚胎发现有巨大的房间隔缺损，心室和心室肌的异常也被发现[2]。相关研究发现Foxa2这些基因在心脏和内脏器官发育过程中扮演重要角色，该基因的主要功能是调节内胚层发育，Foxa2基因表达显著下调后，会出现心脏的间隔缺损[3]。本研究旨在研究NIPBL+/-小鼠模型中房间隔缺损的形成与Foxa2基因表达关系。为CdLS的诊断和干预提供新的策略。

1 材料与方法

1.1实验动物:对照组为6只雄性NIPBL+/+小鼠子代。实验组为6只雄性NIPBL+/-小鼠子代，由北京百奥赛图基因生物技术有限公司提供。实验动物的喂养严格按照石河子大学动物饲养规定，光照时间控制在12/12 h ，温度(21±2)℃。

1.2主要试剂:荧光定量PCR试剂盒(Qiagen 公司，德国)，cDNA合成试剂盒(Thermo-fermentas 公司，美国)。

1.3体重测量：分别测量小鼠4周后时体重。每只反复测量三次保证数值准确性。

1.4实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR )检测小鼠心脏组织Foxa2的mRNA水平:①于4周后取出小鼠心脏。②用Trizol 法提取心脏组织的总RNA，采用紫外分光光度计(Thermo NanoDrop 2000)测量总RNA的浓度与纯度，当260 nm/280 nm在1.8～2.0范围内时，按照cDNA合成试剂盒(Thermo-fermentas 公司，美国)说明书进行逆转录。③Foxa2基因引物设计、合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物序列为：上游引物：5′- TCCGACTGGAGCAGCTACTAC -3′，下游引物：5′- GCGCCCACATAGGATGACA -3′；β-Actin上游引物：5′- CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC -3′，下游引物：5′- TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT -3′。④采用荧光定量PCR试剂盒(Qiagen 公司，德国)在64孔 ABI Prism7300 序列检测系统 (美国应用生物系统公司)进行扩增。内参基因与目的基因各重复3次，同时设3个阴性对照，建立总体积为20 μl的反应体系，反应条件为：95℃，2 min(1个循环)；95℃，5 s ；60℃， 30 s(40个循环)，循环结束后得到扩增曲线；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，30 s，60℃，15s后得到溶解曲线。

2 结果

2.1两组小鼠生长发育比较:两组小鼠体重在4 w时相比，实验组体重(35.03±2.94)显著小于对照组体重(43.19±2.57)，且差异具有统计学意义P<0.05,t=6.027。见图1。

图1 两组小鼠4周时体重比较

2.2两组小鼠心脏组织中Foxa2 mRNA表达：小鼠心脏组织中Foxa2 mRNA的表达相比实验组为4.14±4.07，与对照组的9.67±6.73比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

3 讨论

CdLS是一类少见的累及多器官系统与遗传有密切关系的先天性疾病，其中生长发育迟缓以及先天性心脏病(Congenital Heart Disease，CHD)是公认的特征。而CdLS患者的死亡原因与其先天性器官发育异常有密切关系，其中并发CHD的患者，死亡率可高达15%。在CHD的患者当中又可表现为法洛四联征、单心室等畸形，但以室间隔和房间隔缺损是最为常见的[4]。在相关研究显示NIPBL突变引起的CdLS不是染色体分离异常引起，而是 Nipbl和Cohesin复合物对由于基因表达调节的异常造成的[5]。Chatfiel等人发现Foxa2基因在心脏和内脏器官发育过程中扮演重要角色，该基因的主要功能是调节内胚层发育，当Foxa2表达显著下调后，会出现心脏的间隔缺损[3]。

在本研究中发现，NIPBL+/-小鼠子代在生长发育过程中体重明显低于NIPBL+/+小鼠子代，这可能是由于NIPBL+/-小鼠子代基因表达以及分子蛋白结构的表达异常造成，在两组小鼠的心脏房间隔处的Foxa2基因表达中，实验组明显低于对照组，这可能是由于实验组NIPBL基因的缺陷导致Foxa2基因表达降低，从而引起房间隔的缺损。本研究中全部选用雄性小鼠，主要是避免雌性鼠在其性周期中因雌激素水平变化而影响结果的准确性。

综上所述，NIPBL+/-基因缺陷鼠中Foxa2基因表达降低，在一定程度上导致小鼠生长发育迟缓，体重下降，可能是造成小鼠心脏房间隔缺损的原因，本实验通过探讨Foxa2基因表达对小鼠心脏房间隔缺损的影响，为先天性心脏病的诊断和干预及降低出生病患率提供了新的思路。