活性维生素D3对UUO模型大鼠P38MAPK信号通路的影响

张国锐 贾林 杨晓萍 赵瑾 陶林

(石河子大学医学院 1第一附属医院肾病科，新疆 石河子 832000；2病理教研室)

慢性肾脏疾病(CKD)发展至终末期肾衰竭的主要病理基础和共同途径是肾间质纤维化(RIF)，成纤维细胞及肌成纤维细胞(MyoF)异常增生，过量的细胞外基质(ECM)，在肾间质内沉积最终导致纤维化，活性维生素D3除经典的调节钙磷代谢作用外，还具有多种其他生物学效应，CKD病人通常较正常人存在低活性维生素D3，推测活性维生素D3减少可能参与肾脏疾病的发生与发展，有研究发现其可以保护足细胞，增加肾小球肾病蛋白(Nephrin)的表达，减少尿蛋白，改善肾脏功能〔1〕。近期亦有研究发现活性维生素D3可以改善RIF，目前未明确其具体机制。本试验通过建立单侧输尿管梗阻(UUO)肾间质纤维化模型，观察活性维生素D3对P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及磷酸化(p)-P38MAPK蛋白表达的影响，探讨活性维生素D3改善RIF的机制。

1 资料和方法

1.1实验方案及模型建立

1.1.1主要实验试剂和试验动物 活性维生素D3由青岛海尔制药公司提供，以花生油为溶剂，配制浓度为0.5 μg/ml，兔抗人p-P38MAPK单克隆抗体、兔抗人P38MAPK单克隆抗体 、小鼠抗人β-action单克隆抗体(美国Cell Signaling公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗免疫球蛋白(Ig)G二抗(中国北京中杉金桥)；Masson三色染色试剂盒(福州迈新生物工程有限公司)。4周龄清洁级健康雄性SD大鼠54只，体重(200±20)g，由新疆医科大学实验动物中心购得，石河子大学医学院中心实验室中适应性喂养1 w，室温下自然饮水、进食(石河子大学实验动物中心提供饲料)。

1.1.2大鼠模型分组 54只雄性SD大鼠，随机分为UUO模型组(模型组)、活性维生素D3干预组(干预组)、假手术组，模型组和干预组共计36只大鼠，大鼠左肾下极处游离并结扎左输尿管，建立UUO模型； 18只SD大鼠开腹后仅游离左输尿管，作为假手术组；干预组在建模起给予1 ml花生油，其中加入活性维生素D30.5 μg，每天1次灌胃，共计14 d，而假手术组、模型组每天仅给予花生油1 ml灌胃。

1.1.3标本收集 分别于术后第3、7、14天处死3组大鼠各6只，收集左侧肾脏标本。把左侧肾脏标本分成两份，一份用4%甲醛固定后制成蜡块，另一份立即用生理盐水冲洗，然后放在液氮罐中用于蛋白质的提取，蜡块由专业技师切成3 μm厚的切片，病理染色用。避免取材过程中的污染。

1.2免疫组化染色 HE染色：将切片在60℃烤箱中烤15～20 min；常规脱蜡，切片用清水冲洗水化；放入苏木素染液中染色5 min，取出用清水冲洗3 min；盐酸酒精(1%)水化15 s，再次清水冲洗1 min；将切片放入清水中，5 min蓝化；取出后切片放入伊红染液中染色2 min，然后清水冲洗；切片依次在80%酒精、90%酒精、95%酒精、无水酒精中浸泡5 min脱水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡5 min；盖玻片固定，封片，晾干；

Masson染色：将切片在60℃烤箱中烤15～20 min；常规脱蜡，自来水冲洗切片水化；滴加100 μl Masson复合染色液5 min，蒸馏水冲洗；滴加100 μl磷钼酸染色5 min，甩干；滴加100 μl苯胺蓝染色，染色5 min，蒸馏水冲掉，擦干；滴加100 μl分化液，分化30～60 s；梯度酒精依次脱水5 min，然后二甲苯透明5 min；中性树胶固定，封片晾干。

光镜下观察肾小管间质损害程度并进行病理分级，石河子大学病理教研室两位专家单独观察结果。间质损害结果的判定方法： 0级(0分)：无病理损害表现；Ⅰ级(1分)：局部可见少量炎性细胞，轻度的肾小管扩张，未见到明显肾间质纤维化，病理损害范围< 25%；Ⅱ(2分)级：炎性细胞局灶浸润，中度肾小管扩张，可见萎缩，肾间质可见成纤维细胞弥漫分布，病理损害范围25%～49%；Ⅲ级(3分)：可见大量炎性细胞，弥漫分布，重度肾小管坏死，RIF明显，肾脏病理损害范围≥50%。阳性结果判定：选高倍镜下(×400)5个小管间质视野(避开肾小球和大血管)量化染色细胞的面积和强度，算出平均值，最后结果为两位专家的结果均值。

1.3Western印迹法检测P38MAPK、p-P38MAPK表达 适量的肾组织充分研磨，置于RIPA 匀浆缓冲液中匀浆，4℃，离心力12 000 r/min，离心20 min，取上清液，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。配平后加入5×上样缓冲液，使用掌心式离心机离心30 s，混匀后将EP管置于水浴锅中，100℃，8 min煮沸；待蛋白冷却后，于-20℃冰箱中保存备用。

预制的10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶中加入适量的组织匀浆标本蛋白，电泳分离，转膜，封闭，洗涤后，用含P38MAPK及p-P38MAPK及β-actin 抗体的5%脱脂牛奶三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)平衡液孵育。洗涤后，再用5% 脱脂牛奶TBS平衡液，其中含辣根过氧化酶标记二抗，孵育标本膜。再次充分洗涤后，使用电化学发光(ECL)试剂盒显影曝光；曝光后采用凝胶成像仪采图、Gel-Pro analyzer分析系统进行灰度分析。

1.4统计学方法 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1肾脏病理损害 模型组随建模时间的延长，肾间质增宽，炎细胞的浸润范围增大，间质细胞增生明显，纤维化逐渐加重，与假手术组比较病理积分差异有统计学意义(P<0.01)；干预组炎细胞浸润、纤维化程度较模型组显著减轻，病理积分差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

表1 不同时间三组大鼠肾小管间质损害程度积分

与假手术组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.05；下表同

图1 肾脏免疫组化染色(×400)

2.2Western印迹法检测 与假手术组相比，模型组p-P38MAPK蛋白表达量随时间延长显著增加(P<0.01)；干预组p-P38MAPK蛋白表达量较模型组显著减少(P<0.05)；P38MAPK蛋白表达量各组无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、表3、图2。

表2 各组不同时间p-P38MAPK蛋白表达

表3 各组不同时间P38MAPK蛋白表达

F：假手术组；M：模型组；U：干预组；β：β-actin

3 讨 论

目前应用最为广泛的研究RIF的实验动物模型是UUO模型。手术结扎单侧输尿管，肾脏积水,导致肾脏功能的改变并慢性肾脏结构的损害，因肾积水,肾血流稀疏，巨噬细胞浸润,纤维细胞增殖,进而形成瘢痕,最终导致RIF,出现肾衰竭。该模型已成熟，且相对制作简单,重复性较好,RIF发生迅速,可观察到肾脏细胞转分化过程。

1，25-二羟维生素D3〔1,25-(OH)2D3〕是体内维生素D3的活性形式，它能够调节机体免疫系统的功能，对多种细胞的增殖有抑制作用，诱导多种细胞的凋亡和分化，保护基因，对脏器有保护功能〔1〕。1,25-(OH)2D3可通过多种途径改善或延缓RIF的过程，但其机制尚不清楚〔2〕。

RIF与肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(TEMT)过程关系密切；研究表明肾小管上皮细胞可以通过TEMT过程转变成为可以分泌ECM的MyoF，参与RIF的发生与进展；目前发现蛋白尿、TGF-β1、肝细胞生长因子(HCG)、肾组织局部肾素-血管紧张素系统(RAS)、核因子(NF)-κB等因素与RIF有关〔3,4〕。本研究前期的研究已证实整合素连接激酶(ILK)、E-钙黏素、转化生长因子(TGF)-β1等与RIF密切相关，且活性维生素D3可以通过调节ILK、E-钙黏素、TGF-β1等因子改善RIF，但是活性维生素D3改善RIF的具体机制尚不明确MAPK是真核生物细胞主要信号转导通路之一，P38MAPK属于MAPK的亚族，目前P38MAPK同型异构体已知的有6种：P38α1/α2，P38γ和P38δ，P38β1/β2，在全身组织细胞中广泛表达〔5〕。当细胞受到外界刺激后(如促炎因子、高渗、低氧、紫外线、放射线、热休克及其他应激反应)MAPK激酶 (MAPKKK)磷酸化，并将磷酸化基团向下游传递，继而MAPK激酶(MAPKK)，活化的MAPKK通过P-MAPK的苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)位点，活化MAPK，将细胞外刺激信号传递给胞核〔6〕；有学者证实：P38MAPK活化可以加速TEMT进程〔6〕，本研究团队前期研究已在人类肾小管上皮细胞中证实高糖可促进P38MAPK活化，增加p-P38MAPK蛋白表达，促进TEMT进程，而QLT0267可抑制P38MAPK的活化，减少磷酸化P38MAPK蛋白表达，延缓TEMT进程〔7〕。

本研究结果与前期动物模型试验结果一致；Western印迹法观察P38MAPK及p-P38MAPK蛋白表达量显示：UUO模型组在第3天既出现磷酸化P38MAPK蛋白表达增加，并随时间的延长、肾间质病理损害程度的加重而表达增加，磷酸化P38MAPK蛋白的表达与病理积分呈正相关，分析其原因可能是UUO模型建立以后，随着梗阻时间延续，炎细胞浸润明显，炎症介质的释放增加，磷酸化P38MAPK蛋白表达开始增加〔8〕，而P38MAPK的活化可以促进TEMT〔6〕，加速RIF的发生，这与Luo等〔9〕的研究一致；本研究结果提示：活性维生素D3干预后P38MAPK活化受到抑制，磷酸化P38MAPK蛋白水平降低，分析可能原因：①活性维生素D3可抑制UUO模型肾脏炎症反应，从而减轻P38MAPK的激活。②ILK是MAPKs家族上游蛋白，本研究团队前期试验已证明活性维生素D3可抑制UUO大鼠模型肾组织中ILK的表达，而ILK作为P38MAPK的上游信号分子，P38MAPK活化受到抑制可能与ILK表达下调有关。

综上，活性维生素D3可以间接或直接下调UUO大鼠肾组织p-P38MAPK蛋白水平，抑制P38MAPK的活化,延缓EMT发生，从而减轻RIF而保护肾脏功能，为防治RIF提供了新的研究方向和治疗靶点，本团队将会继续就活性维生素D3对TEMT及RIF保护作用做进一步研究。