海南黎族与汉族持续性房颤老年患者CYP2C9*3基因多态性差异分析

白敏 陈向红 郭照军 陈磊 王超 吴曾繁

(海南医学院第二附属医院心血管内科，海南 海口 570311)

持续性房颤患者存在高血管栓塞的风险，临床治疗指南推荐持续性房颤患者口服华法林抗凝，并且临床研究也证实华法林可有效预防持续性房颤患者的血栓形成及降低血管栓塞概率〔1〕。华法林会显著影响体内凝血-抗凝系统，目前临床主要通过国际标准化比率(INR)进行动态监测〔2〕。但在临床实践中发现，华法林临床应用剂量的个体差异较大，剂量很难用相对统一的药代动力学公式进行计算。研究证实，以细胞色素P450酶(CYP)2C9*3为代表的某些基因多态性分布是造成华法林维持剂量个体差异的主要因素之一〔3，4〕。海南省是我国黎族居民聚集地区，使用华法林的持续性房颤黎族患者数量逐年上升，目前尚没有临床研究对黎族患者群体的CYP2C9*3多态性分布特点及对华法林维持剂量影响进行评估，因此本研究对此进行探讨。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2017年1月至2018年12月于海南医学院第二附属医院住院就诊的持续性房颤黎族患者100例作为研究组，其中男53例，女47例；年龄61～73岁，平均年龄(67.5±5.9)岁,平均病程(18.5±8.6)个月，体重指数(24.6±1.8)kg/m2。其中扩张型心肌病11例，缺血性心脏病89例。同期选取医院住院的持续性房颤汉族患者100例为对照组，其中男55例，女45例；年龄62～75岁，平均年龄(68.3±6.7)岁,平均病程(20.1±9.4)个月，体重指数(23.8±2.0)kg/m2。其中扩张型心肌病10例，缺血性心脏病90例。

纳入标准：(1)临床确诊为持续性房颤；(2) 合并慢性心力衰竭，纽约心脏病学会(NYHA)分级为3～4级；(3)服用华法林达到稳定剂量，平均每个月监测1次INR。排除标准：(1)合并有严重肝肾肺等重要脏器功能不全；(2)同时服用阿司匹林、胺碘酮、维生素K等影响华法林代谢药物及影响CYP活性药物；(3)罹患活动性溃疡、支气管扩张等出血性疾病；(4)罹患血液病、凝血系统障碍及甲状腺功能异常等疾患。

本研究患者相互间均无血缘关系，且均对本研究知情，并自愿签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会审批通过。两组患者年龄、性别比、病程、体重指数及原发疾病等方面差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2基础信息采集 收集两组患者主要基本信息，主要为：姓名、性别、民族、年龄、体重、吸烟状况、诊断、INR、INR达标时间、华法林平均日用量和达标时华法林总用量、服药时间及合并用药、富含维生素K食物摄入情况等。华法林稳定剂量计算公式为：实际华法林剂量/INR值。

1.3CYP2C9基因分型检测

1.3.1基因组DNA提取 两组患者均在入组后次日清晨空腹抽取肘静脉外周血5 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)-Na抗凝管中，加红细胞裂解液摇晃5～6次，在室温下放置10 min，获得白细胞，应用英国Crawley公司的DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA。提取DNA样本成功后，置于-20℃冰箱保存待检。

1.3.2扩增阻滞突变体系-聚合酶链式反应技术(ARMS-PCR)基因分型 采用ARMS-PCR和DNA 直接测序技术对CYP2C9*3(1075A-C)基因进行基因分型，根据既往参考文献〔3〕合成引物序列为：正义链：5′-CATGCA AGACAGGAGCCAC-3′及反义链：5′-TTGGGAATG AGATAGTTTCTGAATT-3′，扩增和测序引物为上海生工公司合成。PCR扩增时以GAPDH为阳性对照，扩增条件PCR反应体系为25 μl，其中10×PCR缓冲液12.5 μl、引物探针混合液6.5 μl、超纯水4 μl、基因组DNA 2 μl。应用美国安捷伦 Mx3000荧光定量PCR仪器进行PCR，反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，57℃复性0.5 min，60℃延伸0.5 min，30个循环后72℃延伸10 min。

1.4华法林浓度测定 两组患者入组后接受华法林口服治疗，定期监测INR，维系INR 1.35左右，此时采集患者的肘静脉外周血5 ml，1 500 r/min离心5 min，将血浆转移至专用离心管(型号：Nanosep 10K,购自美国Pall公司)，在37℃水浴1 h后，2 400 r/min离心10 min，将离心后的200 μl超滤液中加入0.1 mol/L乙酸20 μl，震荡30 s，再加入乙酸乙酯1 ml，震荡2 min，再5 000 r/min离心5 min，取800 μl上清液在氮气下吹干，再加入100 μl复溶液震荡1 min后14 000 r/min高速离心10 min。最后将上清液转移至进色谱及质谱条件色谱柱(Acquity UPLC BEH C18，50 mm×2.1 mm)检测华法林浓度〔5〕。

1.5统计学方法 采用SPSS21.0软件进行统计处理。采用Hardy-Weinberg 遗传平衡检验群体代表性。不同基因型间华法林剂量比较均先进行Levene方差齐性检验。两组间均数比较采用成组t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1CYP2C9*3(1075A-C)基因型频率和等位基因频率比较 研究组A/A与A/C基因型显著低于对照组(P<0.05)，C/C基因型显著高于对照组(P<0.05)；而研究组等位基因A频率显著低于对照组(P<0.05)，C频率显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组CYP2C9*3(1075A-C)基因型及等位基因频率比较〔n(%),n=100〕

2.2两组不同基因型患者的血清华法林浓度比较 两组不同基因型患者的血清华法林浓度均存在差异，均为A/A型最大(P<0.05)，而A/C型与C/C型无显著差异(P>0.05)；研究组A/A基因型患者的血清华法林浓度显著低于对照组(P<0.05)，但两组A/C与C/C基因型患者的血清华法林浓度没有显著差异(P>0.05)。见表2。

2.3两组不同基因型患者华法林稳定剂量比较 两组不同基因型患者的华法林稳定剂量均存在差异，均为A/A型最大(P<0.05)，而A/C型与C/C型无显著差异(P>0.05)；研究组A/A基因型患者的华法林稳定剂量显著低于对照组(P=0.019)，但两组A/C与C/C基因型患者的华法林稳定剂量没有显著差异(P>0.05)。见表3。

2.4研究组不同基因型患者华法林抗凝效果比较 不同基因型黎族持续性房颤患者的INR达标时间、华法林平均日剂量及总剂量均存在差异，顺序均为：A/A>A/C>C/C (P<0.05)。见表4。

表2 两组不同基因型患者的血清华法林浓度比较

与A/A比较：1)P<0.05；表3同

表3 两组不同基因型患者的华法林稳定剂量比较

表4 研究组不同基因型患者华法林抗凝效果比较

3 讨 论

随着国内冠心病、慢性心力衰竭、高血压等心血管疾病发病率维持高水平，持续性房颤发生率也呈逐年增加趋势〔6〕。华法林被公认能有效预防房颤病人血栓形成，然而华法林临床应用的安全窗较小，剂量难以确定，即便定期监测INR调整剂量，也易存在剂量不足或过量，进而导致血栓或出血事件发生，至今理想的INR水平国内外尚无统一的标准〔7〕。近年来精准医学发展认为，华法林稳定剂量存在较大的族群个体差异主要原因是与华法林剂量维持相关的基因存在着遗传多态性〔2，6〕。华法林的主要代谢酶，即CYP基因多态性是华法林遗传药理学研究的热点，也是被认为影响华法林剂量需求最主要的因素〔4〕。

CYP2C9主要存在于人体肝脏中，是目前研究最广泛、最深入的一种CYP家族基因〔8〕。华法林主要通过CYP2C9基因编码蛋白酶代谢，CYP2C9基因突变会导致该酶代谢活性发生改变，因此CYP2C9基因多态性能影响华法林稳定剂量〔9〕。CYP2C9有多个的突变位点，目前对于基因多态性种族差异主要集中在CYP2C9*3等位基因，研究证实CYP2C9*3基因具有低华法林代谢活性，分别较CYP2C9-1纯合子降低代谢活性80%左右〔10〕。因此与CYP2C9-1纯合子相比，CYP2C9-3等位基因更容易增加出血的风险，达到同样抗凝效果剂量需求则更低，达到稳定的INR所需时间更长。

不同种族之间CYP2C9*3等位基因发生频率在的差异较大〔11〕，白种人的CYP2C9*3等位基因的发生频率较高，为6%～10%，而亚洲人CYP2C9*3的频率仅为1%～2%〔5〕。由此导致不同种族间华法林维持剂量存在显著差异，黄种人平均维持剂量显著低于白种人和黑种人〔12，13〕。国内研究也显示内蒙古地区和南方地区人群的CYP2C9*3等位基因发生频率存在差异，这也显示国内不同地区或民族的华法林维持剂量也存在差异〔14〕。

本研究显示，罹患持续性房颤黎族患者的C/C基因型占优势，而汉族患者A/A与A/C基因型占优势，与此同时等位基因C频率在持续性房颤黎族患者中占有显著优势，而持续性房颤汉族患者中A频率占优势，这提示等位基因C或CC基因型是持续性房颤黎族患者华法林稳定剂量的相关基因，而AA基因型频率在汉族人群中比率最高。A/A基因型持续性房颤黎族患者的华法林稳定剂量及血清华法林浓度均高于A/C型与C/C型，这一点与对照组汉族A/A基因型患者也是最高相同，表明黎族与汉族C/C基因型或等位基因C患者华法林稳定剂量及血清华法林浓度较低，发生出血性事件危险均较小。同时研究也表明相同A/A基因型持续性房颤患者中，黎族患者华法林稳定剂量及血清华法林浓度低于汉族，而A/C与C/C基因型则无差异，这显示仅A/A基因型患者的华法林剂量及浓度存在族群差异，这值得临床进一步研究。C/C基因型黎族持续性房颤患者的INR达标时间、华法林平均日剂量及总剂量最低，而且安全性较好，这也从临床表现上分析证实C/C基因型或等位基因C会降低持续性房颤黎族患者华法林稳定剂量及稳态达标时间。