不同温度及乙醇含量对生料醋醅中醋酸菌产酸能力的影响

李 阳，张丽珍，杨 埔，张一中

（1.山西大学生命科学学院，山西太原 030006；2.山西省农业科学院高粱研究所，山西晋中 030600）

食醋在春秋时期就有记载，是一种常见的酸味调味料，通常以粮食为主料，加入大曲后进行糖化、酒精发酵、醋酸发酵[1]，再加水淋制最终得到成品醋的过程。发酵过程中微生物种类众多、成分丰富，含有多种维生素、氨基酸[2]，还有黄酮、酚酸[3]等有益成分，在降低血压[4]、缓解疲劳[5]等方面有显著效果，因此人们对食醋的需求也越来越高。传统食醋的酿造原料需要经过蒸煮，生料醋的特色就是原料与发酵剂混合后直接发酵[6]，酿造过程中反应类型更多、更复杂[7]，因此口感与传统食醋相比更加醇厚。

醋酸菌在酿造过程中扮演重要角色，负责将乙醇氧化成乙酸[8-9]，过高的乙醇含量会抑制微生物的生长[10]，不适的温度会破坏发酵酶类的活性[11]，因此探究合适的初始乙醇含量和发酵温度尤为重要。关于生料醋醅中醋酸菌的研究相对较少，可以参考的数据不多。陈洋[12]从浙江等醋厂中筛选出了耐10%乙醇、耐40℃高温的醋酸杆菌，经16S rDNA鉴定为巴氏醋杆菌，并研究了其耐乙醇机制。胡宇豪等人[13]对耐12%乙醇的巴氏醋杆菌的培养基进行了优化，得出在常规培养基中加入5.5%乙醇、0.5%乙酸时，产酸量可以最大程度地提高。李文等人[14]从腐烂的猕猴桃中筛选出一株醋酸菌，耐40℃高温、耐12%高醇，经研究可使产酸量提高30.54%。向进乐等人[15]从木瓜醋中检测出了草酸、酒石酸等10种有机酸，且醋酸含量最高。目前，生料醋的研究尚存在较多空白，比如有机酸的类型、高温、高醇对其发酵性能的影响等。

试验以自然发酵的生料醋醅为样品，分离纯化出醋酸菌菌种，再通过菌落形态特征、产酸定性试验、16S rDNA序列的分析对其进行鉴定。发酵过程中添加不同含量的乙醇，研究不同温度下对醋酸菌产酸特性的影响，研究成果可以作为优化醋酸发酵的数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 培养基

基础培养基：葡萄糖10 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨4 g/L，琼脂12 g/L，1.6%溴甲酚紫4 000 μL，灭菌后加入3%无水乙醇。

发酵培养基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，琼脂12 g/L，接种前加入5%无水乙醇。

1.1.2 试剂

无水葡萄糖，山东西亚化学工业有限公司提供；硫酸镁，天津市北辰方正试剂厂提供；磷酸二氢钾，北京精求化工厂提供；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司提供；无水乙醇，天津欧博凯化工有限公司提供；琼脂粉，北京索莱宝科技有限公司提供；甲醇（色谱纯）、甘油，北京博奥拓达科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪，安捷伦科技公司产品；超净工作台，苏净安泰AIRTECH产品；AD-88型大容量全温气浴振荡器，常州国宇仪器制造有限公司产品；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；MS7-H550-Pro型磁力搅拌器，SCILOGEX产品。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌的筛选

从发酵了12，18，24，30，36 d的醋醅中采样约10 g，再分别加入装有50 mL蒸馏水的锥形瓶中，于28℃条件下，以转速180 r/min振荡培养30 min，将样品稀释至10-3，吸取50 μL涂布至基础培养基，于28℃恒温培养箱中培养，菌落长出后，多次分离纯化，直至长出单一菌落，最后挑取菌落加入到甘油培养基中，于-20℃的冰箱中保存备用。

1.3.2 产酸定性试验

挑取菌种于发酵培养基活化2次，接入到加有溴甲酚紫酸碱指示剂的基础培养基，于28℃条件下培养2～3 d，可使培养基变成黄色的菌株为产酸细菌。

1.3.3 菌种鉴定

筛选出菌种后编号为1，观察其形态特征并进行分子生物学鉴定，确定其分类地位。

1.3.4 醋酸菌的产酸特性试验

醋酸菌涂布发酵培养基，于恒温培养箱活化2～3 d，挑取已活化的菌株接种到试管发酵培养液，于振荡培养箱培养1～2 d，吸取2%的发酵培养液至锥形瓶培养48 h，从0 h开始，每隔12 h采一次样。乙醇体积分数设置6个梯度，分别是0，2%，4%，6%，8%，10%；培养温度分别为37，42，47℃，通过高效液相色谱仪测定产酸类型和产酸量。

1.3.5 高效液相色谱条件

产酸高效液相色谱检测条件参照杨钰昆等人[16]的测定方法。色谱柱为AQ-C18；流动相为甲醇∶磷酸二氢钾 （0.02 mol/L） 为 3∶97（V/V），磷酸调 pH值至2.7，流速1.00 mL/min，柱温30℃，检测波长210 nm，进样量 10 μL。

1.3.6 数据处理

将通过3次重复试验得到的数据利用SPSS 20软件分析和Excel软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 醋酸菌的鉴定

2.1.1 醋酸菌的分离

菌落形态见图1。

该菌长势良好，菌落为白色小圆形，表面光滑，边缘整齐。

2.1.2 醋酸菌的鉴定

（1）形态学鉴定。挑取醋酸菌滴至有无菌水的载玻片上，干燥后用草酸铵结晶紫染液染色60 s，纯净水冲去多余染液，干燥后进行光学显微镜观察。菌体呈短棒状，单个或多个排列。

显微镜观察图见图2。

（2）分子生物学鉴定。

醋酸菌的系统发育树见图3。

2.2 37℃条件下发酵过程中有机酸的含量变化

2.2.1 乳酸含量变化

乳酸含量变化见图4。

图2 显微镜观察图

图3 醋酸菌的系统发育树

图4 乳酸含量变化

由图4可知，不同乙醇含量的发酵液中，乳酸均呈增加趋势。乳酸含量受乙醇体积分数影响较大，发酵48 h后，乙醇体积分数为8%和10%的培养液中乳酸含量最低，为2.6 mg/mL；添加量为2%时，乳酸含量达到最大，为4.7 mg/mL。

2.2.2 乙酸含量变化

乙酸含量变化见图5。

由图5可知，乙醇体积分数为2%时乙酸含量由0增加到1.8 mg/100 mL；添加8%和10%乙醇时，发酵0 h检测到乙酸含量为0.34 mg/100 mL和-0.36 mg/100 mL，可能是种子培养基代入，12 h后下降到0；添加0，4%，6%乙醇在发酵过程中没有检测到乙酸。

2.2.3 柠檬酸含量的变化

柠檬酸含量变化见图6。

由图6可知，乙醇含量为4%时柠檬酸含量最高，发酵24 h含量最大，为0.08 mg/mL，高于添加量为8%的柠檬酸含量。不同的乙醇添加量对发酵过程中柠檬酸含量的影响各不相同，其中添加量为10%时柠檬酸含量最低，可见高浓度乙醇含量不利于醋酸菌的发酵。

图5 乙酸含量变化

图6 柠檬酸含量变化

2.3 42℃条件下发酵过程中有机酸的含量变化

2.3.1 乳酸含量变化

乳酸含量变化见图7。

图7 乳酸含量变化

由图7可知，乙醇添加量越少，发酵过程中乳酸含量增加越多，发酵48 h添加6%乙醇的培养液中，乳酸含量最高达到3.9 mg/mL；添加量为10%的乙醇在发酵至48 h时，乳酸含量最低，为3.1 mg/mL。

2.3.2 乙酸含量变化

乙酸含量变化见图8。

由图8可知，乙醇添加量为8%时，在48 h检测到乙酸含量为3.4 mg/100 mL，高于37℃乙酸的最高含量；添加10%乙醇，发酵液中乙酸含量维持在2.5～3.4 mg/100 mL，高于添加6%乙醇检测到的乙酸含量；添加0，2%，4%乙醇在发酵过程中没有检测到乙酸。

2.3.3 柠檬酸含量变化

柠檬酸含量变化见图9。

图8 乙酸含量变化

图9 柠檬酸含量变化

由图9可知，乙醇添加量越少，对发酵过程中柠檬酸含量的影响越低，发酵过程中柠檬酸均呈增加的趋势，添加量为4%的发酵液中柠檬酸含量最多，48 h达到0.17 mg/mL。

2.4 47℃条件下发酵过程中有机酸的含量变化

2.4.1 草酸含量变化

草酸含量变化见图10。

图10 草酸含量变化

由图10可知，不添加乙醇的培养液中草酸含量最高，48 h含量达到2.5 mg/100 mL，在整个发酵过程中，添加2%乙醇的培养液中生成的草酸为1.7 mg/100 mL，均高于其他乙醇添加量；添加10%时草酸含量增加最低，发酵至48 h只有1.03 mg/100 mL。

2.4.2 乙酸含量变化

乙酸含量变化见图11。

图11 乙酸含量变化

由图11可知，除0外，不同乙醇添加量的发酵液中，乙酸含量都呈增长趋势，其中添加2%的乙醇时乙酸含量最高，发酵48 h可达1.97 mg/100 mL；不添加乙醇的培养液中乙酸含量为0，可见乙醇可促进乙酸的生成。

2.4.3 乳酸含量变化

乳酸含量变化见图12。

图12 乳酸含量变化

由图12可知，乳酸含量在发酵24 h内都有不同程度的下降，24～48 h继续增长，可能是由于发酵初期营养物质消耗太快，乳酸作为碳源被利用。观察不同乙醇含量对乳酸的影响，得出添加2%的乙醇，乳酸含量最高，发酵48 h达到5.02 mg/mL；添加4%乙醇乳酸含量最低，在48 h检测只有3.19 mg/mL，低于42℃培养条件下检测到的乳酸含量，可见温度也是影响发酵的关键因素之一。

3 结论

试验从生料醋醅中筛选出醋酸菌，经形态学和16S rDNA鉴定为巴氏醋杆菌，通过改变其发酵过程中的温度和乙醇添加量，研究其对醋酸菌产酸特性的影响。

温度设置37，42，47℃3个梯度，乙醇添加量设置0，2%，4%，6%，8%，10%6个梯度。将2%的种子培养液接入发酵液后通过高效液相色谱检测样品，检测到的有机酸有草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸，比赵方圆等人[17]的试验结果多一类草酸。不同温度、乙醇含量对有机酸的生成影响较大，乙醇添加量为10%时有机酸的生成都受到了抑制，可见高浓度的乙醇会影响微生物的活性，与张月阳等人[18]的研究结果一致。37，42，47℃3个温度下最适宜有机酸生成的乙醇添加量分别是4%，6%，2%，耐受性低于孙文瑛等人[19]从腐烂水果中筛出的耐11%乙醇的醋酸菌。分析不同温度下几种有机酸的产酸量，可知42℃更适宜巴氏醋杆菌产酸，此菌株对温度的耐受性高于邵建宁等人[20]研究的耐40℃高温的醋酸菌。检测到的有机酸中，乳酸含量最高为5.0 mg/mL，在42℃，8%乙醇条件下乙酸含量最高为4.2 mg/100 mL，二者在醋中均是含量最高的有机酸，与方冠宇等人[21]的研究结果一致。草酸、柠檬酸的含量最高时分别是2.5 mg/100 mL，0.17mg/mL，这类不挥发有机酸的存在很好地中和了乙酸带来的刺激感，使醋的酸味更加柔和爽口。

通过对生料醋醅中的巴氏醋杆菌进行研究，挑选出发酵的最适温度和最适乙醇含量，优化生产工艺，最大程度增加生料醋中有机酸的含量，提升生料醋的口感，也为生料醋产品的进一步开发提供参考。