铜离子介导的石墨烯量子点荧光开-关高选择性检测谷胱甘肽

李欣玉 张 强 王 妮 刘加军 王 健*

(发光与实时分析系统重庆市市级重点实验室1，国家级药学实验教学示范中心2， 西南大学药学院， 重庆 400715)

1 引 言

作为一种含有活性巯基的短肽，谷胱甘肽(GSH)参与了体内的多种生化反应，如可防止体内某些含巯基蛋白质的氧化，保障体内代谢的正常进行[1]; GSH的巯基可与体内的自由基结合，防止自由基对体内器官的损伤[2]。另外，癌细胞中的GSH含量明显高于正常细胞，且GSH的耗竭与肿瘤细胞凋亡有密切关系，因此，监测细胞中GSH的含量有利于监控人体健康状况[3]。近年来已开发出多种检测GSH的方法，包括荧光法[4]、散射法[5]、比色法[6]、电化学[7]、高效液相色谱[8]等，但有些方法易受半胱氨酸等巯基化合物的干扰[9]，因此，有必要开发高灵敏、选择性的方法，实现GSH的选择识别[10]。

石墨烯量子点(GQDs)的尺寸通常小于10 nm，因制备简单且具有良好的生物相容性、优异的光学性质和较强的成像能力，被认为是荧光染料和半导体量子点的理想替代品[11,12]，被广泛用于生物传感[13，14]及细胞成像[15，16]。目前。大部分检测策略基于GQDs与靶物直接作用，但方法的选择性差、抗干扰能力不强，因此，需要开发新的策略，以提高方法的选择性。其中，荧光信号开-关策略是一种有效手段[17]，该方法能够提高信号单向变化检测模式的选择性。在典型的开-关策略中，通常需要中间介质诱导探针信号的降低或升高，介质结合目标物，诱导信号恢复。

本研究利用微波法合成了GQDs，并基于聚集诱导荧光猝灭[18]机理实现了GSH的选择性识别(图1)。GQDs表面富含氨基，可与Cu2+配位而拉近GQDs之间的距离，导致GQDs聚集，进而发生荧光猝灭。在GQDs-Cu2+中加入GSH后，由于GSH与Cu2+之间有更强的结合能力，导致Cu2+从GQDs表面解离，致使GQDs解聚集，从而使荧光恢复。本方法以Cu2+为开关，控制了GQDs荧光信号的猝灭与恢复，据此建立了GSH的检测方法，提高了方法的选择性，并用于细胞裂解液中GSH的检测。

图1 Cu2+介导的石墨烯量子点荧光开-关检测GSH示意图Fig.1 Illustration of Cu2+-mediated fluorescence switching of graphene quantum dots(GQDs) for highly selective detection of glutathione(GSH)

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

F-2500荧光分光光度计(日本日立公司); UV-3600紫外-可见分光光度计、FTIR-8400S傅里叶红外光谱仪、XRD-7000 X射线衍射仪(日本岛津公司); Tecnai G2 F20 S-TWIN高分辨透射电子显微镜(HRTEM，美国FEI公司)，加速电压200 kV; ESCALAB 250 X-射线光电子能谱仪(XPS, 美国赛默飞世尔科技公司); FL-TCSPC荧光光谱仪(法国Horiba Jobin Yvon公司); C11347绝对量子产率仪器 (日本滨松公司); Synergy H1 多功能酶标仪(美国Berton公司); DL-1电子万用炉(北京市永光明医疗仪器有限公司); P70D20P-NPCWO微波炉(格兰氏公司); 离心机(上海安亭科学仪器厂); GDH 9070A鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司); 800Y多功能粉碎机(南阳东亿机械设备有限公司)。

GSH、半胱氨酸、组氨酸、谷氨酸、赖氨酸等生物分子(Sigma公司); CuSO4(阿拉丁试剂有限公司); HCl、NaOH、NaCl等其它无机试剂(成都科龙化学试剂有限公司)。实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm， Mili-Q公司纯水仪制备)。银杏叶采自西南大学校园。

2.2 实验方法

2.2.1 石墨烯量子点的合成先将银杏叶用自来水冲洗干净，接着用蒸馏水冲洗3遍，放入500 mL烧杯中沥干水分，在鼓风干燥箱中60℃烘干，然后用多功能粉碎机制成粉末。称取上述银杏叶粉末约0.6 g，加入40 mL超纯水中并充分搅拌，加热煮沸，保持微沸10 min，之后用0.22 μm滤膜过滤，将滤液继续用微波炉中火加热15 min，使溶液完全蒸干。取出后，加20 mL水，超声处理200 s， 10000 r/min离心10 min，再次用0.22 μm滤膜过滤。边搅拌边逐滴加入0.1 mol/L HCl，调节混合液至中性，最后用透析袋(1000 MWCO)透析48 h，将所得GQDs冷冻干燥，于4℃保存，备用。

2.2.2 细胞毒性实验考察在96孔板中的每孔中加入100 μL A549细胞(1×105cell/mL)，在细胞培养箱中孵育(37℃，5% CO2)24 h后，用PBS缓冲液清洗两次，再分别加入10 μL不同浓度的GQDs (0、10-4、10-3、10-2、0.1、1和10 μg/mL)和90 μL RPMI 1640培养基(添加2%胎牛血清)，继续孵育24 h。用PBS缓冲液清洗2次后，再加入10 μL CKK-8溶液和90 μL RPMI 1640培养基(添加2%胎牛血清)，继续孵育40 min，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，按公式(1)计算细胞存活率(Cell viability, CV)，评价GPDs对细胞的毒性:

(1)

其中，ODtreated为实验组的吸光度，ODcontrol为对照组的吸光度。

2.2.3 GSH的检测在1.5 mL试管中依次加入50 μL BR缓冲溶液(pH 6.8)、 50 μL GQDs (10 mg/mL)、 50 μL Cu2+(2.5 mmol/L)和不同浓度的GSH溶液，混匀后加水稀释至0.5 mL，在室温下静置20 min，测定GQDs的荧光强度。

2.2.4 细胞裂解液中GSH的测定细胞裂解液的制备[19]如下: A549细胞在RPMI 1640培养基(添加2%胎牛血清)中孵育(37℃，5% CO2) 24 h，用胰酶消化，并用PBS缓冲液洗涤2次，然后重复冷冻和解冻，确保细胞完全裂解。为除去细胞碎片和蛋白质，以14000 r/min离心10 min，并用0.22 μm微孔膜过滤，收集滤液，于4℃储存，备用。将20 μL细胞裂解液与50 μL BR缓冲溶液(pH 6.8)、 50 μL GQDs (10 mg/mL)、 50 μL Cu2+(2.5 mmol/L)以及50 μL不同浓度的GSH溶液(500、1000和2000 μmol/L)混匀后，加水稀释至0.5 mL，在室温下静置20 min，测定GQDs的荧光强度。

3 结果与讨论

3.1 石墨烯量子点的特征

3.1.1 石墨烯量子点的形貌结构表征利用透射电镜(TEM)及原子力显微镜(AFM)观察了GQDs的形貌结构(图2)。TEM照片表明，GQDs呈单颗粒均匀分散，平均粒径为2.4 nm，其面内晶格间距为0.33 nm(图2A)，对应于石墨碳的(002)平面，说明合成的碳纳米材料具有类石墨结构[20]。X光衍射(XRD)谱在27.3°有一个宽峰，根据布拉格方程计算出对应0.33 nm处的晶格间距(图2B)。AFM结果(图2C和2D)表明，GQDs的高度约为1 nm，可推断出GQDs由3层左右石墨烯层组成[21]。

图2 GQDs的形貌表征: (A) GQDs的透射电镜照片，内嵌图为GQDs的晶格和粒径分布图; (B) GQDs的X射线衍射谱; (C)和(D)分别为GQDs的原子力显微镜照片和高度分布，其中D图中a～c的高度对应于图C中标记为a～c的GQDsFig.2 Morphological characterization of GQDs: (A) Transmission electron microscope (TEM) image of GQDs. Inset is lattice spacing and size distribution of GQDs; (B) X-ray diffraction (XRD) pattern of GQDs; (C) Atomic force microscope (AFM) image; (D) Height distribution of GQDs, and the heights of a-c in Fig.D corresponding to a-c of GQDs in Fig.C

图3 GQDs的元素和官能团分析: (A) GQDs的X射线光电子能谱(XPS)全谱; (B)C1s谱; (C) N1s 谱; (D) O1s谱Fig.3 Eelemental and functional group analysis of GQDs: (A) X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) full spectrum of GQDs; (B) C1s spectrum; (C) N1s spectrum; (D) O1s spectrum

3.1.2 石墨烯量子点的光谱特征GQDs具有良好的吸收和发射性能。GQDs在紫外-可见区具有非常宽的紫外吸收带，在278 nm处具有肩峰，可归因于纳米碳的π-π*跃迁[16]。荧光光谱表明，GQDs的最大激发波长为360 nm，最大发射波长为463 nm，在365 nm紫外光照射下呈现蓝色(图4A)，量子产率为1.4%，且随着激发光谱的改变，GQDs的发射光谱波长并未发生改变(图4B)，说明此GQDs的粒径或者表面状态比较均一[22]。

图4 (A) GQDs (2.5 μg/mL)的吸收、激发和发射光谱，内插图为石墨烯量子点在白光及365 nm紫外灯照射下的照片; (B)不同激发波长(300～400 nm)对应的发射光谱Fig.4 (A) Absorption, excitation and emission spectra of GQDs (2.5 μg/mL), inset shows photographs of GQDs irradiated by white light and 365 nm UV lamp; (B)Emission spectra of GQDs at different excitation wavelengths in the range of 300-400 nm

3.1.3 石墨烯量子点的稳定性研究一般的碳纳米材料具有良好的稳定性[12]。研究表明，不同的阴阳离子(除Cu2+外)未引起GQDs荧光强度的明显变化，说明GQDs具有优越的抗离子干扰能力(图5A和5B)。在较高浓度的NaCl溶液中，GQDs的荧光强度几乎没有降低，说明GQDs具有很好的抗盐能力(图5C)。同时，研究了GQDs的抗光漂白能力，发现GQDs在紫外光照射2 h后仍保持较高的发光强度(图5D)，说明GQDs具有较强的光稳定性。但是GQDs荧光发射依赖于环境的酸度，在酸性条件下，其荧光强度较低; 中性和碱性条件下，其荧光强度较为稳定(图5E)。综上，此GQDs比较稳定，有利于GQDs在复杂样品中的进一步应用。

图5 浓度均为2 mmol/L的 (A)阴离和(B)阳离子对GQDs荧光强度的影响; (C)不同浓度的NaCl对GQDs荧光强度的影响; (D) 365 nm紫外灯的连续照射对GQDs荧光强度的影响; (E)不同酸度条件对GQDs荧光的影响。 GQDs浓度均为2.5 μg/mL; F0为GQDs的荧光信号，F为加入其它物质后GQDs的荧光信号Fig.5 Fluorescence response of GQDs to (A) various anions and (B) various cations at 2 mmol/L respectively;; (C) The fluorescence response of GQDs to different concentrations of NaCl; (D) Fluorescence response of GQDs fluorescence under 365 nm UV light irradiation; (E) Fluorescence response of GQDs under different acidities. Conditions: cGQDs: 2.5 μg/mL; F0 is the fluorescence intensity of GQDs; F is the fluorescence intensity of GQDs in the presence of the species

3.1.4 石墨烯量子点的生物相容性研究结果表明，碳纳米材料具有较好的生物相容性[12]。为了评价GQDs的生物相容性，使用CKK-8法测定A549细胞存活率。 如图6所示， 当GQDs浓度为1 μg/mL时， 细胞存活率大于90%，说明GQDs对细胞的毒性较小。

图6 不同浓度GQDs处理后的A549细胞存活率Fig.6 Cell viability of A549 cells treated with different concentrations of GQDs

3.2 基于石墨烯量子点的荧光法检测GSH

3.2.1 条件优化考察了酸度、反应时间及Cu2+浓度等因素对检测灵敏度的影响。GQDs-Cu2+混合液与GSH反应20 min后，GQDs的荧光强度趋于稳定，说明已反应完全(图7A)。因GQDs的荧光强度依赖于环境的酸度，故GQDs-Cu2+与GSH的反应也依赖于环境酸度(图7B)。结果表明，中性条件下，Cu2+能较大程度地猝灭GQDs的荧光，且GSH与Cu2+结合后能够引起荧光信号的恢复，而酸性和碱性条件都不利于GQDs与Cu2+之间的配位。一方面，在酸性条件下，GQDs的氨基发生质子化，不利于与Cu2+配位[23]; 另一方面，在碱性条件下，Cu2+容易水解，不利于与GQDs进行配位反应。酸性和碱性条件都不利于荧光的猝灭，加入GSH后，荧光恢复程度也不大。故选择pH 6.8的BR缓冲溶液控制溶液的酸度。

采用荧光恢复效率(F2/F1)筛选Cu2+的最佳浓度，使其在“关”态和“开”态之间达到最佳效果。当Cu2+的浓度过低时，会导致“关闭”效率低下，加入GSH后，GQDs的荧光信号恢复程度较低; 当Cu2+浓度过高时，溶液中有大量游离的Cu2+直接与GSH结合，不能有效地恢复荧光，即“开启”效率较低。当Cu2+浓度为250 μmol/L时，荧光恢复效率达到最佳(图7C)。

图7 反应条件的优化: (A)反应时间的影响，1 μg/mL GQDs， pH 6.8; 250 μmol/L Cu2+， 500 μmol/L GSH; (B)酸度的影响， 1 μg/mL GQDs，反应时间 20 min，250 μmol/L Cu2+， 500 μmol/L GSH ; (C) Cu2+浓度的影响， 1 μg/mL GQDs， pH 6.8，反应时间 20 min，500 μmol/L GSH。F1为加入Cu2+后GQDs荧光强度; F2为在GQDs-Cu2+混合液中加入GSH后的荧光强度Fig.7 Optimization of reaction conditions: (A) Effect of reaction time. 1 μg/mL GQDs, pH 6.8, 250 μmol/L Cu2+, 500 μmol/L GSH, (B) Effect of acidity, 1 μg/mL GQDs, reaction time is 20 min, 250 μmol/L Cu2+; 500 μmol/L GSH; (C) Effect of Cu2+concentration, 1 μg/mL GQDs, reaction time is 20 min, pH 6.8, 500 μmol/L GSH. F1 is the fluorescence intensity of GQDs in the presence of Cu2+; F2 is the fluorescence intensity of GQDs-Cu2+ mixture in the presence of GSH

3.2.2 基于GODs检测GSH的方法的分析性能最佳实验条件下，在GQDs-Cu2+混合液中加入GSH，GQDs的荧光强度逐渐恢复(图8A)。 GSH浓度在 20～500 μmol/L范围内与荧光信号的恢复程度(F2/F1)呈良好的线性关系(图8B)，检出限(LOD，3s/k)为3.4 μmol/L，与色度法[6]和电化学-试纸条法[7]相比，本方法较灵敏，且选择性好(图8C)，半胱氨酸(Cys)等物质不干扰GSH的检测。这是因为作为一种嗜硫金属离子，Cu2+对巯基化合物具有较强的结合力[24]; 且GSH的空间结构特殊， 具有巯基、氨基和羧基3个潜在的配位位点[25]，与Cu2+的结合常数最高[26]，因此本方法具有较好的选择性。

图8 方法的分析性能和选择性: (A) GQDs随GSH浓度变化的荧光光谱; (B)GQDs荧光恢复程度与GSH浓度的线性关系, 1 μg/mL GQDs， 250 μmol/L Cu2+，反应时间 20 min，pH 6.8; (C) GQDs检测GSH的选择性，1 μg/mL GQDs， 250 μmol/L Cu2+，反应时间 20 min，pH 6.8，氨基酸及GSH的浓度均为300 μmol/L. F1为加入Cu2+后GQDs荧光强度; F2为在GQDs-Cu2+混合液中加入GSH或氨基酸后的荧光强度Fig.8 Performance and selectivity of the proposed method: (A) Fluorescence spectra of GQDs in the presence of different concentrations of GSH; (B) Linear relationship between F2/F1 and the concentration of GSH, 1 μg/mL GQD, pH 6.8, reaction time is 20 min, 250 μmol/L Cu2+; (C) Selectivity of GQDs towards determination of GSH, 1 μg/mL GQDs, pH 6.8, reaction time is 20 min, 250 μmol/L Cu2+, the concentrations of amino acids and GSH are 300 μmol/L respectively. F1 is the fluorescence intensity of GQDs in the presence of Cu2+; F2 is the fluorescence intensity of GQDs-Cu2+ mixture in the presence of GSH or amino acids

3.2.3 细胞裂解液中GSH的检测为了验证GQDs-Cu2+混合物检测GSH的可行性，测定了A549细胞裂解液中的GSH，并进行了加标回收实验(表1)。GSH是哺乳动物细胞内最丰富的抗氧化剂，且在大多数细胞中，超过90%的细胞内硫醇分子是GSH[19]。本研究以A549细胞为模型细胞，采用2.2.4节的方法将细胞裂解液稀释20倍， 测定GSH的平均含量为197.8 μmol/L，计算得A549细胞裂解液中原始GSH含量为3.96 mmol/L，与细胞中GSH的正常浓度(0.5～10 mmol/L)[27]相吻合，表明本方法可用于细胞裂解液中GSH的检测。细胞裂解液中GSH的回收率为93.2%～101.5%，相对标准偏差(RSD)为4.4%～5.8%，表明所建立的GSH检测方法具有良好的实用性。

表1 细胞裂解液中GSH的检测结果

Table 1 Detection results of GSH in cell lysate (n=3)

样品Sample测得量Found(μmol/L)加入量Spiked(μmol/L)总测得量Total found(μmol/L)回收率Recovery(%)RSD(%, n=3)1190.250.0236.893.25.82198.8100.0295.296.44.43204.5200.0407.5101.55.6

3.3 石墨烯量子点检测GSH的机理

由于GSH是一种含有巯基的三肽，作为一种嗜硫金属离子，Cu2+对GSH具有较强的结合力[24]; 而GSH具有特殊的空间结构，具有巯基、氨基和羧基3个潜在的配位位点[25]，与Cu2+的结合常数高[26]，形成更稳定的配合物，因此在GQDs-Cu2+复合物中加入GSH后，Cu2+从GQDs表面竞争下来，使GQDs聚集体发生解聚，从而导致GQDs荧光恢复。

图9 反应机理的研究: (A) Cu2+存在时GQDs吸收光谱的变化; (B) Cu2+存在时GQDs的TEM照片; (C) Cu2+存在时GQDs的红外光谱的变化; (D) Cu2+存在时GQDs的荧光寿命的变化Fig.9 Mechanism investigation: (A) Absorption spectral change of GQDs in the presence and absence of Cu2+; (B) TEM image of GQDs in the presence of Cu2+; (C) Infrared spectral change of GQDs; (D) Fluorescence lifetime change of GQDs

4 结 论

利用微波法合成了表面富含氨基的GQDs，以此GQDs为光学探针, 以Cu2+为开关，开发了GSH的高选择性检测方法。表面富含氨基的GQDs与Cu2+发生配位作用而发生聚集诱导荧光猝灭，由于GSH与Cu2+结合能力更强，使Cu2+从GQDs解离，导致GQDs解聚而发生荧光恢复。GSH和Cu2+的较强的配位作用及荧光“开-关”作用赋予本方法优异的选择性，应用于细胞裂解液中GSH的检测,结果令人满意。 本方法可针对其它目标进一步推广，有利于提高方法的选择性。