DNS法测定手参肾宝胶囊中多糖含量

孙跃宁，李怀平，罗明英，刘有菊

（1.金诃藏药股份有限公司 藏药新药开发国家重点实验室，青海 西宁 810003；2.金诃藏药（山东）健康产业有限公司，山东 济南 250101）

手参肾宝胶囊是由手参、黄精、天冬、烈香杜鹃、冬虫夏草五味药味组成，具有温肾补阴，填精补髓的作用，可用于肾阳不足，精血亏虚，遗精阳痿，腰膝酸软，眩晕乏力。手参肾宝胶囊现行标准[WS-10550（ZD-0550）-2002-2011Z][1]中使用蒽酮-硫酸法测定总多糖含量。多糖提取一般采用热水提取、乙醇除杂质，缺少进一步分离纯化的步骤，常含影响定量测定的杂质如蛋白质、单糖、色素、苷等。采用蒽酮-硫酸法测定多糖含量，单糖类杂质直接与蒽酮反应使实测值偏高；蛋白质、苷类杂质在酸性环境中水解后与蒽酮反应使实测值偏高；色素类杂质使待测样品本身带有颜色从而影响测定结果[2]。此法不能排除还原性杂质（包括单糖）干扰，且显色剂极易氧化而影响比色[3]；重现性差、测定溶液稳定时间短[4]，同时使用大量具有强腐蚀性的硫酸，危险性高。文献报道3,5-二硝基水杨酸（DNS）法操作简便、快速、灵敏度高，且测定结果受杂质干扰较小，可排除单糖等杂质带来的误差。本文采用DNS法测定手参肾宝胶囊中多糖含量，为其质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-2450型紫外分光光度计（日本岛津）。

1.2 试药

DNS（自制）；D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110833-201707，含量：99.5 %）；手参肾宝胶囊（金诃藏药股份有限公司，批号：01180709，01180718，01190129）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取无水葡萄糖对照品10 mg，置入10 ml量瓶，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1 ml含无水葡萄糖1 mg）。

2.2 供试品溶液的制备

取本品内容物0.3 g，精密称定，置入100 ml量瓶，加热水80 ml，置沸水浴加热40 min，取出，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液8 ml，置入25 ml量瓶，加6 mol/L盐酸溶液8 ml，置沸水浴中加热40 min，取出，放冷至室温，加酚酞指示液2滴，用饱和氢氧化钠溶液调至微红色，加水稀释至刻度，摇匀，作为总糖供试品溶液。再精密量取上述续滤液6 ml，置入10 ml量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，作为还原糖供试品溶液。

2.3 最大吸收波长的确定

取对照品溶液0.4 ml，加水至1 ml；再取供试品溶液中总糖供试品溶液及还原糖供试品溶液各1 ml，分别置入25 ml量瓶，加DNS溶液1.5 ml，混匀，沸水浴中加热5 min，取出，立即冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀，以相应试剂为空白，照分光光度法在400～600 nm波长范围内进行扫描。图谱显示，上述样品在485±2 nm处有最大吸收，但文献报道520 nm更有利于完成实验[5]，为确定更有利于手参肾宝胶囊多糖含量测定的波长，分别于0，1，2，4，6 h测定供试品吸光度值，计算RSD，见表1。由表1可见，520 nm处测定结果更加稳定，与文献报道一致，选定520 nm为检测波长。

表1 不同波长处供试品溶液吸光度值

2.4 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液（浓度为1.0746 mg/ml）0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，置入25 ml量瓶，分别加水至1.0 ml，分别精密加入DNS试液1.5 ml，混匀，沸水浴中加热5 min，取出，立即冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀，以相应试剂为空白，照分光光度法（中国药典2015年版四部通则0401），在520 nm波长处测定吸光度（A），以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标（C），绘制标准曲线。回归方程：A=0.01839C+0.01030，r=0.9981。结果表明：在8.597～42.984 μg/ml范围内，多糖的吸光度与浓度线性关系良好。

2.5 测定法

精密量取总糖、还原糖供试品溶液各1 ml，分别置入25 ml量瓶，照标准曲线的制备项下，自“精密加入DNS试液1.5 ml”起，依法测定吸光度。从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量（mg），以总糖量减去还原糖量，即得。

2.6 精密度试验

取2.3项下供试品溶液，连续测定6次，记录吸光度值。吸光度RSD为0.10 %，表明方法精密度良好。

2.7 重复性试验

取手参肾宝胶囊样品（批号：01190129）6份，按2.2项方法制备供试品溶液，按2.5项方法测定多糖含量。结果显示，多糖含量均值为103.02 mg/粒，RSD为1.91 %，表明方法重复性良好。

2.8 回收率试验

取已知含量的胶囊内容物（批号：01190129，总糖含量：541.5 mg/g）约40 mg，精密称定，置入25 ml量瓶，精密加入对照品20 mg，加水20 ml，置沸水浴加热40 min，取出，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液8 ml，置入25 ml量瓶，加6 mol/L盐酸溶液8 ml，置沸水浴中加热40 min，取出，放冷至室温，加酚酞指示液2滴，用饱和的氢氧化钠溶液调至微红色，加水稀释至刻度，摇匀，作为总糖供试品溶液。共配制6份。按含量测定方法测定总糖含量，计算回收率及RSD。结果见表2。结果表明：该方法测定结果准确，方法可行。

表2 回收率试验结果表

2.9 中间精密度试验

取本品（批号：01190129），按2.5项方法，分别由不同分析人员，在不同时间采用同一设备检测，多糖含量RSD值为0.6 %。结果表明：本方法中间精密度良好。

2.10 样品含量测定结果

取3批手参肾宝胶囊样品（01180709，01180718，01190129），按2.5项方法方法测定多糖的含量。结果见表3。

表3 手参肾宝胶囊多糖含量测定结果

3 结论

手参肾宝肾宝胶囊组方精选手参、冬虫夏草等五味名贵药材，组方合理、性味平和，具有温肾补阴之效，是藏医治疗肾阴虚的经典方剂，现收载于《藏医常用验方荟萃》。本研究建立了手参肾宝胶囊中多糖含量测定方法，该方法简便准确，回收率高、精密度好、重现性好、分析快速等优点，可有效控制手参肾宝质量。本法参照益肾康胶囊质量标准[6]，摸索了DNS法测定总多糖的方法，方法学研究表明：该法准确性高、重现性好、操作简便，能更好地控制手参肾宝胶囊的质量，保证了产品的安全、有效、质量可控。