负载辣椒碱的羟基磷灰石/二氧化硅复合纳米粒的制备及其药动学研究

余剑吟，廖有武，顾正清，朱 源

（江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013）

辣椒碱（capsaicin）是辣椒中含有的一种辛辣的生物碱成分[1]，来源于茄科植物辣椒的成熟果实，是常用的食品添加剂中的活性成分。在临床上主要用于治疗风湿性关节炎等神经性疼痛，可作为一种作用较温和、副作用较少的超长效止痛剂使用[2]。近年，科学家发现辣椒碱具有抗炎[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、减肥[6]等多种活性。但辣椒碱的刺激性、难溶性和吸收差成为其口服制剂开发的瓶颈。已有报道表明，纳米载体如脂质体[7]、微乳[8]、纳米胶束[9]的包覆作用可提高辣椒碱的口服吸收并降低其胃黏膜刺激性。羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）由钙磷灰石自然矿物化形成，广泛应用于骨组织再生、修复、牙科整形及相关治疗[10]，近年亦广泛用作基因传递的非病毒载体[11]及抗肿瘤药、抗生素、抗炎药等药物传递的缓控释载体[12]。口服HA作为蛋白质、多肽类药物的载体也有相关报道[13]。作为一种常见的无机材料，HA具有较好的降低辣椒碱刺激性的作用，但单一组分的HA存在脆性大、降解速度不易控制等缺点[14]。本文在制备纳米HA的基础上，将二氧化硅（SiO2）引入复合载体体系，通过SiO2包覆于载药HA表面实现辣椒碱的控制释放，同时考察该复合载体对于辣椒碱体内外释药特性的影响，并考察SiO2用量对复合纳米粒体系体内外性质的影响。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BSA124S-CW电子天平（北京赛多利斯）；JY92-II型超声波细胞粉粹机（宁波新芝）；低温冷冻高速离心机（德国Hereaus公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒）；HJ-6A六联磁力加热搅拌器（江苏金坛佳美仪器厂）；THZ-82水浴恒温振荡器（江苏金坛中大仪器厂）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；Avatar 370傅立叶变换红外光谱仪（美国Nicolet公司）；JSM-7001F扫描电镜（日本电子公司）；D8 ADVANCEX-射线衍射仪（德国Bruker公司）；岛津LC-20ATV高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

1.2 试药

辣椒碱原料药（上海远慕，批号：180821，含量＞95 %）；辣椒碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110839-201806，含量99 %）；硝酸钙，磷酸，三乙醇胺，正硅酸四乙酯，无水乙醇，氨水，乙酸乙酯，环己烷等试剂（分析纯，国药集团）；甲醇，乙腈（色谱纯，国药集团）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 负载辣椒碱的HA/SiO2复合纳米粒的制备

2.1.1 纳米HA的制备 称取适量硝酸钙[Ca(NO3)2·4H2O]置烧杯中，加水20 ml，超声溶解，将超声波探头置于硝酸钙水溶液中，超声处理（功率：600 W，20 s/次，间隔3 s）20次，逐滴加入磷酸，使Ca:P（摩尔比）=1.67，继续逐滴加入氨水10 ml，超声处理20次，得乳白色混悬液，10 000 r/min离心10 min，所得沉淀用无水乙醇和水各洗涤3次，转移至蒸发皿中，加入少量水分散，置于真空干燥箱中（50 ℃，-100 kPa真空度）干燥，得粉末状纳米HA。

2.1.2 负载辣椒碱的HA/SiO2复合纳米粒的制备 按2.1.1 项下工艺操作，加入适量磷酸后，逐滴加入溶解有2 g辣椒碱的无水乙醇-氨水（3:1）溶液40 ml，超声处理20次，得乳白色混悬液。取混悬液15 ml，置100 ml三颈瓶中，65 ℃水浴，磁力搅拌下逐滴加入三乙醇胺0.45 ml，继续滴加适量正硅酸四乙酯（TEOS），5 h后，10 000 r/min离心10 min，沉淀用水洗涤3次，转移至蒸发皿中，加入少量水分散，于真空干燥箱（50 ℃，-100 kPa真空度）干燥，得负载辣椒碱的HA/SiO2复合纳米粒。为考察TEOS加入量对负载辣椒碱的HA/SiO2复合纳米粒成形、释药行为及药动学特征的影响，制备时TEOS用量分别为3，7.5，15 ml，制得3种载辣椒碱的HA/SiO2复合纳米粒，分别标记为处方1、处方2、处方3。

2.2 载辣椒碱的HA/SiO2复合纳米粒性质评价

2.2.1 色谱条件 负载药物的复合纳米粒中药物含量采用高效液相色谱（HPLC）测定，紫外检测器检测，具体色谱条件如下：色谱柱为Symmetry®C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（含0.1 % 磷酸）（70:30），流速为1.0 ml/min，柱温为30 ℃，检测波长为280 nm。

2.2.2 标准曲线的建立 取适量的辣椒碱对照品，精密称定，用甲醇溶解后配制浓度分别为0.5，1.0，5.0，10.0， 25.0，50.0 μg/ml的辣椒碱对照品溶液。精密量取对照品溶液20 μl，注入效液相色谱仪中，记录样品峰面积。以辣椒碱峰面积为纵坐标（Y），辣椒碱对照品溶液浓度为横坐标（X），最小二乘法进行线性回归，得标准曲线为Y=13 922X+467.76，线性范围0.5～50 μg/ml，表明辣椒碱浓度与其HPLC峰面积有良好的线性关系（r=0.9999）。

2.2.3 方法学验证

2.2.3.1 精密度试验 取辣椒碱对照品适量， 精密称定，用甲醇溶解后配制浓度分别为1.0，25.0，50.0 μg/ml的辣椒碱对照品溶液。精密量取对照品溶液20 μl，注入效液相色谱仪。高、中、低3个浓度对照品溶液含量RSD分别为2.13 %，1.36 %，2.57 %（n=5），表明该方法精密度较好。

2.2.3.2 准确度试验 取辣椒碱对照品适量， 精密称定，用甲醇溶解后配制浓度分别为1.0，25.0，50.0 μg/ml的辣椒碱对照品溶液。精密量取对照品溶液20 μl，注入效液相色谱仪。测得高、中、低3个浓度对照品溶液的平均回收率分别为99.5 %±1.26 %，103.1 %± 1.92 %和99.1 %±1.44 %（n=5），RSD分别为1.27 %，1.86 %和1.45 %，表明该方法准确度较高。

2.2.3.3 稳定性试验 取辣椒碱对照品适量， 精密称定，用甲醇溶解后配制浓度分别为1.0，25.0，50.0 μg/ml的辣椒碱对照品溶液。分别在0，2，4，8，12，24，36，48，72 h精密量取对照品溶液20 μl，注入效液相色谱仪。高、中、低3个浓度对照品溶液在72 h内含量RSD分别为2.53 %，0.91 %，1.20 %，表明该方法稳定性较好。

2.2.4 载药量测定 取载辣椒碱HA/SiO2复合纳米粒（处方1、处方2、处方3）各约50 mg，精密称定，置于离心管中，分别加入甲醇3 ml、乙醇3 ml，4000 r/min超声处理20 min，取上清，沉淀继续重复以上操作2次，合并上清，按2.2.1项下色谱条件操作，将峰面积代入标准曲线方程，计算样品的载药量，载药量=纳米粒中药物量/纳米粒重量，结果见表1。由表1可见，随着TEOS加入量的增加，复合纳米粒的载药量降低，当TEOS用量达15 ml时（处方3），载药量极大降低。以乙醇为溶剂测得的载药量高于甲醇，其原因可能是辣椒碱在乙醇中溶解度较高。HA/SiO2复合纳米粒载药量最高可达约20 mg/100 mg。

表1 复合纳米粒载药量测定结果

2.2.5 载药复合纳米粒形态学考察 取少量载药HA/SiO2复合纳米粒，用导电胶固定于样品座上，喷金，扫描电镜（SEM）观察其形态，结果见图1。由图1可见，载药复合纳米粒电镜形态为类球形分布，当TEOS加入量为3 ml时，载药复合纳米粒粒径约为200～400 nm，随着TEOS加入量增加，载药复合纳米粒粒径逐渐增大，达约1 μm，并有黏聚的趋势。

图1 载药HA/SiO2复合纳米粒SEM照片

2.2.6 HA/SiO2复合纳米粒X-射线衍射（XRD）分析 取HA纳米粒和3种不同处方的HA/SiO2复合纳米粒进行XRD分析。工作条件：CuKα靶，电压40 kV，电流40 mA；测量范围：15～60°；扫描速度：4°/min。结果见图2。与HA纳米粒相比，HA/SiO2复合纳米粒XRD图谱中在20～25°出现较为宽泛的SiO2特征衍射峰，随TEOS用量增加，在25.9°和31.8°等处的HA特征结晶峰显著减小并逐渐消失，说明SiO2对HA的包裹增加，这与SEM观察到的复合纳米粒粒径的增加是一致的。

图2 HA/SiO2复合纳米粒XRD图谱

2.2.7 HA/SiO2复合纳米粒红外（IR）分析 取HA纳米粒和3种不同处方的HA/SiO2复合纳米粒，采用傅立叶变换红外光谱（FT-IR）对其结构进行表征，结果见如图3。HA和SiO2在某些波段的特征峰是重叠的，如1093 cm-1、965 cm-1处有HA中P-O的伸缩振动峰，而在1110 cm-1处有SiO2中Si-O-Si 反对称伸缩振动峰；965 cm-1处有HA中P-O的伸缩振动峰，而SiO2的 FT-IR光谱在970 cm-1处有Si-OH的弯曲振动吸收峰。另有一些特征峰是二者特有的，如566 cm-1、604 cm-1两处HA中P-O的弯曲振动峰在HA/SiO2复合纳米粒图谱中消失；而HA/SiO2复合纳米粒图谱中出现了800 cm-1和470 cm-1左右的Si-O键对称伸缩振动峰，3445 cm-1处较弱的宽峰可能为结构水中-OH的反对称伸缩振动峰。同时，1038 cm-1处HA中的P-O的伸缩振动峰在HA/SiO2复合纳米粒图谱中消失，HA/SiO2复合纳米粒图谱中970 cm-1处的吸收峰应为Si-OH的弯曲振动吸收峰。结果显示，3种处方的HA/SiO2复合纳米粒FT-IR图谱中，HA的特征峰均消失，SiO2的特征峰明显，且随着复合比例中TEOS的用量增大其峰强度也有所增加。

图3 HA/SiO2复合纳米粒FT-IR图谱

2.3 HA/SiO2复合纳米粒体外释药研究

取辣椒碱原料药5 mg及含辣椒碱5 mg的3种HA/SiO2复合纳米粒，精密称定，封装于透析袋（截留分子量3500）中，分别加入相应的释药介质1 ml，两端扎紧后置于锥形瓶中，分别加入pH 1.2盐酸溶液和pH 7.4磷酸盐缓冲液100 ml作为释药介质，37±1 ℃水浴振荡，振荡频率为100 r/min。分别于0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，36，48，60，72 h取样1 ml，同时补充相应释药介质1 ml。按2.2.1项下色谱条件进样测定，计算样品累积释药率。两种介质中辣椒碱原料药和3种载有辣椒碱的HA/SiO2复合纳米粒的体外释药曲线见图4。

由图4可见，TEOS的用量会影响HA/SiO2复合纳米粒中药物的释放速率，随着TEOS用量增多，辣椒碱累积释药率降低。处方1累积释药率在两种介质中均最高。

图4 不同介质中原料药及复合纳米粒的体外释药曲线

2.4 载辣椒碱HA/SiO2复合纳米粒大鼠口服药动学研究

2.4.1 血浆样品预处理方法 取大鼠血浆200 μl，置离心管中，加内标溶液（10 μg/ml α-萘酚甲醇溶液）50 μl和乙腈500 μl，涡旋1 min，加乙酸乙酯和环己烷各1.5 ml，涡旋3 min，4000 r/min离心 10 min，取上清，置干净离心管中，37 ℃水浴氮气挥干溶剂，用甲醇100 μl复溶后涡旋1 min，4000 r/min离心5 min，吸取上清 20 μl，进行HPLC分析。

2.4.2 血浆样品标准曲线的建立 称取辣椒碱对照品适量，甲醇溶解，分别配制浓度为0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 μg/ml的辣椒碱对照品溶液。取空白血浆200 μl加入离心管，分别加入50 μl上述辣椒碱对照品溶液，配制辣椒碱浓度为125，250，500，1000，2000，4000 ng/ml的大鼠血浆标准溶液，按2.4.1项下方法处理后取20 μl，高效液相色谱仪分析，色谱柱为Symmetry®C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为乙腈:水（含0.05 % 磷酸）=45:55，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，检测波长280 nm。以辣椒碱峰面积（As）对内标峰面积（Ai）的比值为纵坐标（Y），辣椒碱血浆标准溶液的浓度为横坐标（X），最小二乘法进行线性回归，得血浆样品标准曲线为Y=0.0001X-0.0031，线性范围125～4000 ng/ml（n=6，r=0.9989）。

2.4.3 动物实验方法 健康雄性SD大鼠18只[180±20 g，SPF,江苏大学动物中心提供，动物使用许可证号：SCXK（苏）2018-0012]，随机分为3组，每组6只，给药前禁食12 h，自由饮水。按90 mg/kg的剂量分别口服灌胃辣椒碱原料药CMC-Na混悬液和2种载辣椒碱的HA/SiO2复合纳米粒（处方1、处方2）的水混悬液，于给药后0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，48，72 h，大鼠眼球后丛静脉采血约0.4 ml，置肝素抗凝管中，4000 r/min 离心10 min，分离血浆，-20 ℃下冷冻存储直至分析，解冻分析前离心处理（10 000 r/min，10 min）。

2.4.4 参数拟合及结果 按2.4.2项下色谱条件测定血浆样品中辣椒碱浓度，采用BAPP2.3生物利用度研究数据处理通用程序（中国药科大学药代中心提供）进行参数拟合，按非隔室模型法计算相关药动学参数。辣椒碱原料药、处方1和处方2的载辣椒碱的HA/SiO2复合纳米粒大鼠体内药时曲线见图5。主要药动学参数见表2。

与原料药相比，载有辣椒碱的HA/SiO2复合纳米粒的t1/2、MRT显著延长，其中t1/2为原料药的5.2～6.2倍，MRT为原料药的4.7～5.7倍，达峰时间显著延长，达到6～12 h，且最大血药浓度提高至原料药的1.6～2.4倍；72 h内体内药时曲线下面积AUC0-72h显著提高，与原料药相比，处方1与处方2的相对生物利用度分别提高至1546.1 %和921.6 %。结果显示，HA/SiO2复合纳米粒能显著提高辣椒碱大鼠体内生物利用度，且具有一定的缓释作用，随着SiO2包覆的增加，生物利用度提高程度有所下降。处方1对于辣椒碱生物利用度的提高更为明显。

图5 辣椒碱原料药及载药HA/SiO2复合纳米粒大鼠口服给药体内药时曲线

表2 辣椒碱原料药及载药HA/SiO2复合纳米粒大鼠口服给药药动参数

3 讨论

本文研究了TEOS用量对所制备的载辣椒碱HA/SiO2复合纳米体系的影响，相比于辣椒碱原料药，复合纳米粒中药物体外释药与体内生物利用度均有所提高，但随着TEOS用量的增加，即SiO2包覆程度的增加，纳米粒的粒径增加，载药量下降，体外累积释药率下降，体内增加口服生物利用度的水平也有所下降。因此TEOS用量的优化对HA/SiO2载药复合纳米粒的增溶、缓释、提高生物利用度作用尤为重要。

除了TEOS用量，HA的纳米化对实现难溶性活性成分辣椒碱的增溶促吸也很重要。本文在构建复合纳米粒体系时，首先考察了制备工艺与参数、前驱体溶液种类与浓度、干燥方式等多种因素，获得了粒径为50 nm左右的纳米HA，为复合载体的构建奠定了基础。

难溶性活性成分的增溶缓释技术与高效传递载体研究是解决其临床应用的重要方向，无机纳米载体因其稳定性和可控释药成为该方向的热点之一。但关于其体内生物降解及其复合体系的协同作用，仍需深入研究，以真正发挥其高效、稳效作用并加速产业化进程。