基于对照制剂和UPLC的牛黄清胃丸中黄柏的质量评价

查祎凡，聂黎行，于健东，张 毅，戴 忠，马双成

（1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.中国药科大学，江苏 南京 211198；3.重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121）

牛黄清胃丸收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第一册》，由牛黄、大黄、菊花、麦冬、薄荷、石膏、栀子、玄参、番泻叶、黄芩、甘草、冰片等17味中药组成，具有清胃泻火、润燥通便的作用，用于心胃火盛，头晕目眩，口舌生疮，牙龈肿痛，乳蛾咽痛，便秘尿赤[1]。现行标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第一册》，除性状外，仅收载了显微鉴别项。制剂中的黄柏为臣药，辅助牛黄清泻胃热的功效，盐酸小檗碱是其主要活性成分[2-4]。本文创新性地将对照制剂引入中成药的质量评价，建立了超高效液相色谱（UPLC）测定牛黄清胃丸中盐酸小檗碱含量的方法，同时研制了牛黄清胃丸对照制剂，对其在生产过程中黄柏的转移进行了考察，提出了相对客观、可行的限度，可望为含黄柏原粉制剂的质量优劣区分提供示范和参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AE240（十万分之一）电子天平，FX-200（万分之一）电子天平（瑞士Mettle Toledo公司）；ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪，Empower工作站（美国Waters公司）；Milli-Q型超纯水处理系统（美国Millipore公司）。

1.2 材料

分析纯甲醇，盐酸（北京化学试剂公司）；硅藻土（北京化学试剂公司）。乙腈（色谱纯，德国 Merck 公司）；水为超纯水；盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201814），人工牛黄对照药材（批号：121197-201204），大黄对照药材（批号：120902-201311），菊花对照药材（批号：121384-201504），麦冬对照药材（批号：121013-201310），薄荷对照药材（批号：120916-201310），栀子对照药材（批号：120986-201610），玄参对照药材（批号：121008-201609），番泻叶对照药材（批号：120996-201205），黄芩对照药材（批号：120955-201309），甘草对照药材（批号：120904-201620），桔梗对照药材（批号：121028-201612），连翘对照药材（批号：120908-201216），冰片对照品（批号：111688-201602），牵牛子对照药材（批号：121024-201606），枳实对照药材（批号：120936-201606，中国食品药品检定研究院）；石膏（北京华邈药业），由中国食品药品检定研究院聂黎行副研究员鉴定为石膏；牛黄清胃丸对照制剂由中国食品药品检定研究院按大生产规模自行研制，其中黄柏原料来自北京同仁堂润丰医药有限公司；炼蜜（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱：AQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；检测波长：265 nm；柱温：35 ℃；流速：0.2 ml/min；进样量：2 μl；流动相：乙腈-水（每100 ml加十二烷基硫酸钠0.2 g）（50:50，v/v，用磷酸调pH至2）。上述色谱条件下，理论板数以盐酸小檗碱峰计应不少于5000，与相邻峰分离度应＞1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加1 %盐酸甲醇制成每1 ml含0.12 mg的溶液，作为对照品储备液。分别精密量取对照品储备液适量，逐级稀释制得浓度分别为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/ml的系列对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取牛黄清胃丸1.0 g，精密加入1 %盐酸甲醇50 ml，85 ℃加热回流1 h，放冷，用1 %盐酸甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 取人工牛黄、大黄、菊花、麦冬、薄荷、栀子、玄参、番泻叶、黄芩、甘草、桔梗、连翘、牵牛子、枳实对照药材，冰片对照品，石膏，按处方比例制备缺黄柏的阴性空白样品，并按2.2.2项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 测定法

取系列对照品溶液和供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样，标准曲线法测定供试品中盐酸小檗碱的含量。

2.4 专属性试验

取2.2项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。结果表明，牛黄清胃丸在盐酸小檗碱的保留时间处无其他成分干扰。

图1 UPLC色谱图

2.5 线性关系考察

分别精密量取对照储备液适量，逐级稀释制得浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.12 mg/ml的系列对照品溶液，进样测定，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线，并进行线性回归，结果盐酸小檗碱在0.02～0.12 mg/ml范围内线性关系良好，回归方程为y=2.42×107x-7.40×105，相关系数（r）为0.9999。

2.6 定量限与检出限

取精密量取浓度为1 mg/L的对照品溶液适量，稀释至不同浓度，进样测定，测得检出限（信噪比3:1）为0.22 μg/ml，定量限（信噪比10:1）为0.90 μg/ml。

2.7 精密度试验

精密吸取2.2.1项下对照品溶液，按2.1项下色谱条件重复进样6次，测定盐酸小檗碱的峰面积。结果，盐酸小檗碱峰面积的RSD为2.23 %（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.8 稳定性试验

取牛黄清胃丸样品（批号：17013549）适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，于室温下放置，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，于室温下放置0，1，2，4，6，8 h，按2.1项下色谱条件进样，测定盐酸小檗碱的峰面积。结果，其峰面积的RSD为1.93 %（n=6），表明室温条件下供试品溶液中的盐酸小檗碱在8 h内稳定。

2.9 重复性试验

取牛黄清胃丸样品（批号：17013549）适量，按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行含量测定。结果，盐酸小檗碱的含量为1.46 mg/g，RSD为1.37 %（n=6），表明本方法的重复性良好。

2.10 加样回收率试验

取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加1 %盐酸甲醇制成每1 ml含0.93 mg的溶液，分成6份，每份1 ml，分别置于圆底烧瓶中，低温挥干，取已知含量的牛黄清胃丸样品（批号：17013549）内容物约0.5 g，精密称定6份，分别加入上述圆底烧瓶中，按2.2.2项下方法制得所需供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定并计算加样回收率，结果详见表1。

表1 牛黄清胃丸加样回收率试验结果（n=6）

表2 牛黄清胃丸样品含量测定结果（n=2）

2.11 样品含量测定

取49批牛黄清胃丸和1批对照制剂各适量，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进样，测定盐酸小檗碱的峰面积，采用标准曲线法计算含量，每批样品平行操作2次，结果详见表2。

2.12 基于对照制剂的等级限度制订

根据《中国药典》的规定、对照制剂和实测样品的含量，对18个厂家、49批样品进行等级评定。为直观显示不同厂家各批次样品盐酸小檗碱的含量差异，做图2。

图2 牛黄清胃丸样品含量测定结果

《中国药典》2015年版一部规定黄柏“含小檗碱以盐酸小檗碱计，不得少于3.0 %”，其中水分项规定“不得超过12.0 %”[5]。取牛黄清胃丸对照制剂投料用黄柏，依法测定盐酸小檗碱含量，结合对照制剂中盐酸小檗碱含量及黄柏在处方中所占比例，计算得到牛黄清胃丸对照制剂中盐酸小檗碱在生产过程中的转移率为98 %。根据牛黄清胃丸中的黄柏药材含量折算相对应的盐酸小檗碱理论含量，得二等制剂的盐酸小檗碱限度为0.74 mg/g，即使用符合药典规定的药材足量投料应达到的含量。暂定对照制剂盐酸小檗碱含量的70 %（1.34 mg/g）为一等限度，即使用优质药材足量投料达到的含量。按上述拟定限度判断，所有批次样品都达到二等限度，29批次样品达到一等限度。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

根据黄柏药材与其他含黄柏的中成药中盐酸小檗碱含量测定的文献[6-9]，采用甲醇、1 %甲酸和1 %盐酸甲醇作为提取溶剂。结果表明，采用1 %盐酸甲醇溶液作为提取溶剂时，提取效率最高，故选定1 %盐酸甲醇溶液为本试验的提取溶剂。

3.2 提取方式的考察

对超声和热回流两种提取方式进行考察，结果显示热回流提取效率更高。对不同热回流时间30，45，60，75 min进行考察，75 min的提取效率相比60 min的提取效率不再显著增加。故选择热回流60 min作为本试验的提取方式。对热回流温度进行考察，结果显示85 ℃下，提取溶剂能保持微沸状态，冷凝管回流液体滴速适中。

3.3 测定方法的选择

与传统的HPLC相比，UPLC具有分离度高、检测速度快、溶剂消耗少、灵敏度高的特点。由于本试验只测定一种成分的含量，故选择UPLC，有利于减少分析时间与溶剂消耗，建立快速的测定方法。

3.4 色谱柱的选择

因牛黄清胃丸处方量较大，成分干扰较多，参考其他文献[10]，采用亲水作用色谱对盐酸小檗碱进行含量测定。但由于提取溶剂酸性较强，导致亲水作用色谱下盐酸小檗碱色谱峰出现分叉，故无法选用。改用适用于较大pH范围的反相色谱柱。

3.5 流动相的选择

参考文献[11]，选用0.5 %甲酸乙腈-0.5 %甲酸水作为流动相，结果发现盐酸小檗碱峰形拖尾严重。参考文献[12]，选用乙腈-0.05 mol/L KH2PO4（用磷酸调pH至3）作为流动相，在盐酸小檗碱峰附近，基线不平稳。参考文献[13]，选用乙腈-水（每100 ml加十二烷基硫酸钠0.2 g）（用磷酸调pH至3）作为流动相，基线平稳，峰形较好，调整pH为2，分离效果最佳。

3.6 对照制剂的意义

中药对照制剂作为中药标准物质的新形式，系指采用道地、优质、规范加工的原料药材（饮片）和辅料，严格按照制法和生产工艺规程，并遵循药品生产质量管理规范制备的实物对照，主要用于中成药的质量控制，评价产品投料的真实性（是否投正确的原料）和投料量的可靠性（是否按处方量投料）[14]。将对照制剂引入中成药等级评价限度的制订，可得到药材有效成分转移率及相对优质制剂的含量等关键信息，保证限度设置的合理性。