米根霉利用木质纤维素生产富马酸的研究进展

李 鑫, 勇 强

(南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037)

木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质资源，具有量大、价廉、环境友好等特点，是潜在规模化生物炼制的原料。我国是木质纤维素资源高产国，农作物秸秆年产大约7亿～8亿吨，林业采伐及加工剩余物等废弃木质纤维素原料每年也有1亿～2亿吨左右[1]。如能实现木质纤维素高效资源化利用，不仅解决农林废弃物资源浪费问题，更可变废为宝，减少环境污染，具有重要的社会效益和环境效益，以及较高的经济效益。米根霉(Rhizopusoryzae)作为根霉属丝状真菌的一种，是美国食品药品监督管理局(FDA)认证的安全菌株，具备多种生物基平台化学品的生物制造能力，如富马酸、乳酸、乙醇等[2-3]。米根霉是公认的最佳富马酸生产菌之一[4]。富马酸，又名反丁烯二酸、延胡索酸、紫堇酸或地衣酸，是最简单的不饱和二元羧酸。最早从延胡索植物(Fumariaofficinalis)中发现提取得到[5]。因富马酸分子中含有一个不饱和的双键，是一种重要的有机化工原料和精细化学品，广泛应用于材料、食品、医药、化工等领域。目前全世界富马酸的产量达到每年9万吨以上，主要采用化学法生产富马酸，以苯为原料，通过顺酐异构化生产富马酸[5]。正是由于富马酸的广泛应用，美国能源部把富马酸列为12种优先发展的平台化合物之一[4]。当前食品级富马酸的售价已经超过10 000元/吨，以廉价、易得、非粮食基的木质纤维素资源为原料，利用米根霉发酵法生产富马酸，一举多得，有利支撑富马酸产业的发展与技术升级。笔者针对米根霉利用木质纤维素原料生产富马酸的技术现状进行综述，从米根霉积累富马酸的代谢途径、木质纤维素原料利用、发酵生产方式以及多联产技术等角度，阐述近年来的研究进展。

1 木质纤维素生物炼制技术路线

木质纤维素资源丰富且廉价，但因结构的复杂性和抗降解性，必须经过预处理，才能破坏其复杂而紧密的结构[6]。木质纤维素经预处理和纤维素酶水解后，降解成可发酵碳源，继而生物转化为生物能源、生物基化学品，同时酶水解产生的木质素固体渣进一步被高值化利用，转化为高附加值产品。这一技术路线被公认为最具应用前景的木质纤维素生物炼制途径[7-9]，如下图所示：

2 米根霉菌积累富马酸的代谢机制

2.1 米根霉可利用的碳源及其产物

米根霉可以代谢多种碳源，底物选择性宽泛，米根霉可利用的碳源包括：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、甘露醇、果糖、蔗糖、木聚糖、果胶、单宁酸、菊粉等[3]。特别需要指出的是米根霉对利用木质纤维原料有其先天优势，可以利用六碳糖(葡萄糖)和五碳糖(木糖)[10]。米根霉的主要代谢产物是富马酸、乳酸、苹果酸、乙醇等。此外，米根霉可产多种生物催化剂，如纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等；同时，米根霉菌体生物质即可作饲料，又可提取细胞壁中的几丁质/壳聚糖和制备葡萄糖胺[11-12]，如图1所示。

图1 米根霉利用多种不同碳源生产不同产物

2.2 米根霉利用葡萄糖积累富马酸的代谢途径

富马酸作为一种重要的代谢中间产物，其在微生物体内积累的机制一直备受关注。富马酸胞内积累机制主要包括乙醛酸支路途径学说和胞液途径学说。乙醛酸支路途径学说，又称“C2+C2”学说，由Foster等于1949年提出，认为富马酸是由两个二碳化合物在根霉菌胞内合成而来[13]；胞液途径学说，又称“C3+C1”学说，Romano等[14]于1967年研究发现根霉菌通过固定CO2来合成富马酸，进而Osmani等[15]在前人的基础上，总结出根霉菌的胞液中存在一条三羧酸循环(TCA)还原途径合成富马酸，提出了胞液途径学说。丙酮酸羧化酶是该途径的关键酶之一，它起着固定CO2的作用，催化CO2与丙酮酸反应生成草酰乙酸，通过苹果酸脱氢酶转化生成苹果酸，最后经过富马酸酶生成富马酸。Kenealy和Wright等的研究结果证实了TCA 还原途径是米根霉内积累富马酸的主要途径[16-17]。因此，在根霉菌中，通过胞液途径合成富马酸成为公认的主流富马酸积累途径(图2)。

图2 米根霉利用葡萄糖和木糖积累富马酸的代谢途径

2.3 米根霉利用木糖积累富马酸的代谢途径

米根霉除了可以利用葡萄糖外，还可以利用木糖发酵产富马酸，特别适合于利用木质纤维基混合碳源(含有葡萄糖和木糖)生产富马酸。有别于葡萄糖，米根霉菌利用木糖的过程中，木糖经木糖还原酶作用转化为木糖醇，此反应需要消耗还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)；而后由依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的木糖脱氢酶作用，将木糖醇转化为木酮糖，同时生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)；木酮糖由木酮糖激酶磷酸化为木酮糖-5-磷酸，木酮糖-5-磷酸进入磷酸戊糖代谢途径生成果糖- 6-磷酸和3-磷酸甘油醛，再经糖酵解代谢途径生成丙酮酸(图2所示)。由于木糖利用过程需要NADPH，部分的葡萄糖- 6-磷酸须进入磷酸戊糖代谢途径再生NADPH，分散了碳流分布，使流向生成丙酮酸方向的碳流减少，降低了木糖转化为产物的代谢流和转化率。此外，生成的NADH参与菌体的氧化磷酸化过程，为菌体提供较多的能量，导致菌体生物量的增加[18]。正是由于二氧化碳的分流作用，与米根霉利用葡萄糖产酸对比，米根霉利用木糖的转化率显著低于利用葡萄糖的转化率[19]。窦畅等[10]研究结果表明以木糖为碳源，米根霉的生物量积累较多，对木糖转化率超过37%。另外，Xu等[20]研究表明米根霉为了应对木糖发酵所带来的氧化压力和生存的需要，消耗较多的碳源，减少了富马酸的生产。

3 米根霉产富马酸的木质纤维原料

木质纤维素是植物的细胞壁的主要成分，其中包含纤维素、半纤维素和木质素等。木质纤维素和蛋白质紧密结合或化学键连接，形成复杂的化学结构，具有显著的抗降解能力[21]，可保护植物细胞。木质纤维素资源包括农业废弃物、造纸工业废弃物、林业加工废弃物等，我国拥有丰富的可再生木质纤维素资源。由于木质纤维素的复杂结构和抗降解性，木质纤维素资源必须经过处理后，转化为可发酵的糖源，可被米根霉生物转化为富马酸。近10年来，国内外米根霉利用木质纤维素资源生产富马酸的研究，如表1所示。目前文献报道用于米根霉发酵产富马酸的木质纤维素资源主要有玉米芯、玉米秸秆、造纸废弃物、牛粪、甘蔗渣、板栗栗苞、麦麸等。 Xu等[22]以酸预处理玉米秸秆为原料，利用米根霉ME-F12发酵产富马酸，产量达到27.79 g/L。笔者课题组以碱预处理玉米芯为原料，利用米根霉CICC40351发酵产富马酸，采用组合发酵方式生产富马酸，富马酸产量最大达到41.32 g/L[23]。Wu等[24]以酸预处理玉米芯为原料，利用能够耐受糠醛的米根霉WHT5生产富马酸，富马酸质量浓度可达49.05 g/L。Deng等[25]以氨预处理甘蔗渣为原料，利用米根霉ATCC20344发酵富马酸，产量达到34.20 g/L。

表1 近10年来米根霉利用木质纤维素资源生产富马酸的研究

4 米根霉产富马酸的发酵方式及联产技术

4.1 分步水解与发酵法

米根霉利用木质纤维素发酵产富马酸，根据木质纤维素糖化和发酵工艺的差异，其发酵方式分为分步水解与发酵法(SHF)、同步糖化发酵法(SSF)以及组合发酵法。分步水解与发酵法(SHF)是指经预处理的木质纤维素原料，首先使其水解(化学法或酶法)成可发酵碳源，然后由微生物再进行发酵。该方法的优点是水解和发酵各自在其最佳的条件下进行，水解得率和产量较高；其缺点是木质纤维素的水解与发酵分步进行，易受到水解产物抑制或发酵底物浓度过高产生的限制作用[18]。近年来，较多研究中应用SHF技术于米根霉发酵产富马酸。Xu等[22]采用酶水解方式水解酸预处理的玉米秸秆，纤维素酶用量为60 FPIU/g葡聚糖水解72 h，葡萄糖和木糖质量浓度分别为31.2和1.8 g/L，水解液经浓缩后，用于米根霉发酵，富马酸的产量和产率分别为27.79 g/L和0.33 g/(L·h)。本课题组以自水解预处理的板栗栗苞为原料，采用酶水解，纤维素酶用量为50 FPIU/g，酶解得率超过95%，米根霉发酵96 h后，富马酸质量浓度达到15.78 g/L，糖酸转化率为0.34 g/g[29]。

4.2 同步糖化发酵法及组合发酵法

同步糖化发酵法(SSF)是指酶水解糖化与发酵在同一反应器中同步进行，具有发酵周期短、成本低、避免底物抑制等优点[31]。Li等[27]以生产低聚木糖的玉米芯废渣为原料，进行米根霉SSF产富马酸，质量浓度达到12.54 g/L，富马酸产量较之SHF过程高1.8倍，显示了利用木质纤维原料SSF产富马酸的优势。SSF过程也存在着一定的局限性，酶水解条件和发酵条件难于统一，不能在各自的最佳条件下进行，使酶水解和发酵均受到一定程度的限制，特别是温度，纤维素酶水解温度一般在45～50 ℃，而米根霉发酵温度一般在28～35 ℃，水解与发酵的温度难于协调一致。有研究从影响SSF的主要因素入手，优化温度和发酵培养条件，实现在38 ℃的较高温度下SSF产富马酸，获得了较高的富马酸产量，说明米根霉能够耐受较高的发酵温度，也避免纤维素酶水解性能的大幅度下降[31]。

现有的米根霉SSF产富马酸的研究中，底物质量分数主要在5%～10%(以绝干固形物计)之间，特别是利用木质纤维原料的SSF，富马酸的产量显著低于淀粉基原料。Deng等[32]报道以玉米淀粉为原料，米根霉DG-3进行SSF产富马酸，玉米淀粉为10%时，富马酸质量浓度达到44.10 g/L。这说明现阶段米根霉SSF研究属于液态浸没式发酵，体系中90%为游离水，是在液态状态下完成糖化与发酵过程。但对于利用木质纤维原料来说，原料的高浓度对于过程经济性和技术要求至关重要，增加底物浓度，可增加产物浓度，有利于降低设备尺寸和能耗，减轻下游分离纯化负担。理想的木质纤维原料起始质量分数的临界值为15%～20% (以绝干固形物计)。高木质纤维原料起始浓度意味着体系内黏度增加，游离水有限，使传质受限，直接影响纤维素酶的水解行为和SSF过程[33]。因此，提高木质纤维原料的底物浓度，对米根霉利用木质纤维素资源产富马酸非常重要。笔者所在课题组开展了高底物浓度的米根霉SSF产富马酸，但研究结果表明一味增加木质纤维原料的底物浓度，富马酸的产量不仅降低，且伴随着副产物乙醇浓度的增加，以及葡萄糖利用率和底物转化率的下降[23]。

米根霉高木质纤维原料浓度SSF过程，不同于无游离水的固态发酵过程，又不同于低底物浓度的液态浸没式发酵过程，是介于两者之间的临界状态。针对高底物浓度SSF过程存在的问题，笔者课题组开展了组合发酵法利用木质纤维原料产富马酸的研究。以碱预处理玉米芯为原料，将SHF和分批补料式SSF有机结合起来，建立了高底物浓度发酵产富马酸工艺技术，底物浓度达到20%，富马酸质量浓度达到41.32 g/L[23]。该组合发酵法，与SHF和SSF发酵法对比，有效克服了SHF和SSF发酵方式存在的问题，显著提高了底物浓度，促进了米根霉利用木质纤维素产富马酸。

4.3 基于发酵法产富马酸的多联产技术

木质纤维原料水解后，水解液中主要单糖组分为葡萄糖和木糖。虽然米根霉兼具利用葡萄糖和木糖的能力，但从利用葡萄糖和木糖产富马酸的效率来看，显然葡萄糖好于木糖[10]。为了克服米根霉利用木质纤维素产富马酸过程中木糖利用率低的问题，Xu等[22]以含木糖的水解液增殖米根霉，提高菌体生物量；再由增殖的米根霉将富含葡萄糖的水解液转化为富马酸。这一研究虽然实现木质纤维素中碳源组分的全利用，但并没有把半纤维素组分转化为有价值产品。既然米根霉发酵过程中产生较多的菌体生物量，学者将实现菌体资源的再利用作为新的研究方向。米根霉菌体中富含壳聚糖，占菌体干质量的13%以上，是较为理想的生物材料[34]。Liao等[26]以牛粪为原料，以米根霉ATCC20344为菌种，联产富马酸和几丁质，富马酸质量浓度为31 g/L，菌体生物量为11.5 g/L，每克菌体含0.21 g几丁质。笔者课题组也开展了联产富马酸和壳聚糖的研究，以10%玉米芯渣为原料，SSF产富马酸，富马酸质量浓度为28.65 g/L；SSF后，采用碱法从米根霉废弃菌体中提取壳聚糖，米根霉壳聚糖的脱乙酰度为90%[35]。与此同时，笔者课题组另辟蹊径，提出了一种新的解决木糖利用率低的思路，即将木质纤维素中的半纤维素组分转化为低聚木糖，而将纤维素组分转化为富马酸。采用碱法预处理玉米芯，分别得到富含半纤维素和纤维素的组分；由米根霉将富含纤维素组分转化为富马酸，富马酸质量浓度达到35.22 g/L；再由内切木聚糖酶将富含半纤维素组分水解制备低聚木糖，低聚木糖得率达到62.35%[36]。低聚木糖与富马酸的联产，实现了木质纤维素碳源组分的高效利用，增加了产品的附加值，有效降低了富马酸生产成本，为木质纤维素生物转化富马酸提供了一种新的途径。

5 展 望

随着市场对富马酸的需求量增加，以及石化资源面临的资源受限和生态环保问题，发酵法生产富马酸前景广阔。木质纤维素是自然界中最为丰富的可再生生物质资源，米根霉利用木质纤维素生产富马酸是富马酸生产的未来发展方向之一，将有助于降低富马酸生产成本，提高木质纤维素的利用价值。因此，基于木质纤维素的发酵法生产富马酸的工程技术研究与开发，包括米根霉发酵性能的提高、木质纤维素的综合利用、发酵方式的改进与提高、多联产技术的应用等，将显著降低发酵法生产富马酸的成本。科技水平的不断进步，必然推动发酵法生产富马酸技术的发展，未来基于木质纤维素的米根霉生产富马酸技术一定可以与基于石化资源的富马酸生产技术相竞争。